Дэа so4: Дегидроэпиандростерон-сульфат (ДЭА-SO4)

Man / GalNAc-4-SO _{4 Рецептор} из печени и легких крыс солюбилизировали в Triton X-100 и инкубировали с агглютинином зародышей пшеницы (WGA) -сефарозой в течение ночи при 4 ° C (11).После удаления несвязанных белков промыванием TBS + 0,1% Triton X-100 связанные гликопротеины элюировали TBS + 0,1% Triton X-100, содержащим 300 мМ GlcNAc. GlcNAc удаляли диализом против TBS + 0,1% Triton X-100. Аликвоты (100 мкл) материала, обогащенного WGA, инкубировали с 25 мкл LH в присутствии 5 мМ EDTA или 25 мкл Man-Sepharose в присутствии 5 мМ CaCl ₂ для стимулирования связывания с Man-специфическими сайтами. Рецептор Man / GalNAc-4-SO ₄ , который был связан либо с LH-сефарозой, либо с Man-сефарозой, элюировали 100 мМ глицином, pH 3.0, 0,1% Тритон Х-100.

Вестерн-блот анализов.

Элюированный Man / GalNAc-4-SO _{4 Рецептор} растворяли в буфере Лэммли при 25 ° C и разделяли невосстанавливающим SDS / PAGE (7,5% акриламида) (21) при 25 ° C. Белки электрофоретически переносили в Immobilon-P (Millipore) в 20 мМ Трис, 150 мМ глицине, 10% метаноле. Перенесенный рецептор Man / GalNAc-4-SO ₄ был обнаружен путем инкубации с моноспецифическим кроличьим рецептором против Man / GalNAc-4-SO ₄ , полученным при иммунизации кроликов кДНК для нативного Man / GalNAc-4-SO _{4 Рецептор} в инъецированном pCDM8 i.м. в физиологическом растворе и бустинг через 4 недели 20 мкг очищенной растворимой химеры Man / GalNAc-4-SO ₄ -HAHis6 в неполном адъюванте Фрейнда. Химера Man / GalNAc-4-SO ₄ -HAHis6 была получена путем замены трансмембранного и цитозольного доменов рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ последовательностью из гемагглютинина гриппа, за которой следовали шесть остатков гистидина (HAH6 ). Рецептор anti-Man / GalNAc-4-SO ₄ использовали в разведении 1: 10 000 и детектировали с помощью хемилюминесценции согласно производителю (NEN).

Анализ поверхностного плазмонного резонанса.

Анализ поверхностного плазмонного резонанса выполняли на приборе Amersham Pharmacia BIAcore 2000. Очищенный рекомбинантный белок A (Pierce) в концентрации 100 мкг / мл в 10 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 4,5 присоединяли к сенсорному чипу BIAcore CM5 с использованием набора для связывания аминов, предоставленного производителем. Химеры Fc, связанные с иммобилизованным белком А, не диссоциировали в ходе анализов связывания. Проточная ячейка, лишенная связанного белка, была использована в качестве контрольной ячейки для корректировки неспецифического связывания и изменений значений единиц ответа, вызванных компонентами буфера.Анализы проводили при 7 ° C и скорости потока 5 мкл / мин в TBS, содержащем 0,005% поверхностно-активного вещества P20 и 5 мМ EDTA. Для измерения аффинности разные концентрации бычьего LH, LHα или LHβ (поставляемые Национальным институтом диабета, болезней пищеварения и почек Национальной гормональной и гипофизарной программой и AF Parlow) связывали в течение 10 минут (50 мкл), чтобы обеспечить достаточное количество время достичь равновесия. Связанные лиганды элюировали путем инъекции импульса 25 мкл 10 мМ Hepes (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0.005% ПАВ Р20. Hepes ( N -2-гидроксиэтилпиперазин- N ‘-2-этансульфоновая кислота) имеет K _i = 2,32 × 10 ^-4 M из-за сульфоната. Контрольные эксперименты проводили в связывающем буфере, содержащем 1 мМ GalNAc-4-SO ₄ , который количественно ингибирует связывание богатым Cys доменом рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ . Кривые насыщения анализировали с помощью нелинейной регрессии (программное обеспечение призмы, V2.0). Для конкурентных исследований возрастающие концентрации ингибиторов добавляли к фиксированной концентрации LHα (685 нМ).

Результаты

Химерные формы рецептора Man / GalNAc-4-SO

Мы использовали химерные формы рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ , в которых трансмембранный и цитозольный домены рецептора были заменены Fc-областью человеческого IgG1, чтобы продемонстрировать, что богатый Cys домен отвечает за связывание терминал GalNAc-4-SO ₄ (18). Химера Man / GalNAc-4-SO ₄ -Fc (Mu1), которая содержит только CRD 1-8, связывает лиганды с концевым Man, но не лиганды с концевым GalNAc-4-SO ₄ .Напротив, химера Fc Man / GalNAc-4-SO ₄ -Fc (Mu11), состоящая из богатого Cys домена, связывает лиганды с концевым GalNAc-4-SO ₄ , но не с концевым Man. Обе химеры Fc образуют ковалентные димеры, которые эффективно секретируются в среду при экспрессии в клетках СНО.

Коэкспрессия кДНК, кодирующих Mu1 и Mu11, в клетках CHO приводит к синтезу и секреции трех различных димерных видов. Большинство видов состоит из ( i ) ковалентно связанного гетеродимера, состоящего из одной цепи Mu1 и одной цепи Mu11, обозначенного Mu1 / 11, и ( ii ) гомодимера Mu11.Также были выражены следовые количества гомодимера Mu1. Гомодимерные и гетеродимерные химеры Fc легко идентифицируются при разделении невосстанавливающим SDS / PAGE (рис. 1). После выделения с помощью аффинной хроматографии на протеин А-сефарозе химеры, меченные ³⁵ S-Cys / Met, инкубировали либо с ман-сефарозой, либо с LH-сефарозой. Количество каждой химеры в несвязанной и связанной фракциях определяли невосстанавливающим SDS / PAGE с последующей авторадиографией (рис. 1). Mu1 / 11 эффективно связывается с Man-Sepharose, но не с LH-Sepharose.Напротив, Mu11 связывается с LH-сефарозой, но не с Man-Sepharose. Таким образом, химеры Fc с одним богатым Cys доменом неспособны связываться с олигосахаридами, несущими GalNAc-4-SO ₄ , на иммобилизованном ЛГ с достаточной стабильностью, чтобы сделать возможным их выделение. Напротив, химеры Fc с двумя богатыми Cys доменами способны связываться с иммобилизованным LH.

Два богатых Cys домена необходимы для связывания с иммобилизованным LH. Man / GalNAc-4-SO ₄ -Fc (Mu1) и Man / GalNAc-4-SO ₄ -Fc (Mu11) котрансфицировали в клетки CHO / Tag30A и метили транс [ ³⁵ S] -меткой. .Секретированные химеры Fc выделяли аффинной хроматографией на протеине А. Химеры Fc инкубировали с ман-сефарозой в TBS, содержащем 5 мМ Ca ²⁺ , или с LH-сефарозой в TBS, содержащем 5 мМ EDTA. Исходный материал для каждой матричной (входной), несвязанной (UB) и связанной (B) фракций исследовали невосстанавливающим SDS / PAGE. Положения Man / GalNAc-4-SO ₄ -Fc (Mu1) 340000 Да, Man / GalNAc-4-SO ₄ -Fc (Mu1 / 11) 220 000 Да и Man / GalNAc-4-SO _{Показано 4} -Fc (Mu11) 98000 Да.

В других исследованиях (данные не представлены) мы охарактеризовали конструкцию Man / GalNAc-4-SO ₄ -HAHis6, в которой трансмембранный и цитозольный домены рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ были заменены на антигенная последовательность гемагглютинина гриппа (22), за которой следуют шесть остатков гистидина. Химера Man / GalNAc-4-SO ₄ -HAHis6 мигрирует как мономер при исследовании с помощью невосстанавливающего SDS / PAGE или гель-фильтрации. Man / GalNAc-4-SO ₄ -HAHis6 не связывается с LH-сефарозой, но связывается с Man-сефарозой.Таким образом, мономерные формы рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ , содержащие все его внеклеточные домены (Cys-богатые, фибронектиновые повторы типа II и CRD 1-8), неспособны связываться с иммобилизованным LH. Свойства этих химерных молекул демонстрируют, что для образования стабильных комплексов с олигосахаридами, несущими GalNAc-4-SO ₄ , на LH требуются два богатых Cys домена.

GalNAc-4-SO

Предыдущие исследования показали, что нативные и рекомбинантные формы рецептора макрофага Man существуют в виде мономеров (17). Однако после солюбилизации в Triton X-100 мы обнаружили мономерный и димерный рецептор Man / GalNAc-4-SO ₄ в препаратах печени, исследованных с помощью невосстанавливающего SDS / PAGE и вестерн-блот-анализа. Далее мы исследовали свойства солюбилизированного рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ , полученного из печени и легких крыс после обогащения с помощью лектиновой аффинной хроматографии с использованием агглютинин-сефарозы зародышей пшеницы.Частично очищенный рецептор инкубировали либо с LH-сефарозой, либо с ман-сефарозой, и относительные количества димерных и мономерных форм рецептора, присутствующих в связанных фракциях, определяли невосстанавливающим SDS / PAGE (фиг. 2). Девяносто семь процентов рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ , полученного из легких, связывает Man-Sepharose (рис. 2). Напротив, 62% рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ , полученного из печени, связывается с LH-сефарозой и 38% — с Man-сефарозой (рис. 2). Девяносто пять процентов рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ , который выделяется из легких и связывается с Man-Sepharose, мигрирует в виде мономера (рис.2 В ). Напротив, 34% рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ из печени, который связывается с LH-сефарозой, мигрирует как димер, тогда как 66% мигрирует как мономер (рис. 2 C ). Доля рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ , которая мигрирует в виде димера, в 10 раз больше для рецептора, который связывается с LH-сефарозой (несущей концевой GalNAc-4-SO ₄ ) по сравнению с рецептором что связывается с Человеком-Сефарозой. Поскольку ожидается, что нековалентные гомодимеры рецепторов диссоциируют во время SDS / PAGE, а электрофоретический перенос на Immobilon-P будет менее эффективным для димерных, чем для мономерных форм рецептора, значение 34% является минимальной оценкой количества димерного Man / GalNAc. -4-SO _{4 рецептора} , присутствующего во фракции, связанной с LH.

Димерные и мономерные формы рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ обнаружены in vivo и связываются с иммобилизованным LH и Man соответственно . Равные аликвоты частично очищенного рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ из печени и легких крысы инкубировали с LH-сефарозой и Man-сефарозой. Связанный рецептор Man / GalNAc-4-SO ₄ элюировали при pH 3,0, разделяли невосстанавливающим SDS / PAGE и электрофоретически переносили в Immobilon-P для вестерн-блот-анализа с использованием моноспецифического кроличьего антитела против Man / GalNAc-4-SO ₄ рецепторные антитела.( A ) Рецептор Man / GalNAc-4-SO ₄ из легких и печени, связанный с LH-сефарозой и Man-сефарозой, соответственно. Количество (условные единицы) мономера (серый) и димера (черный) определяли количественно с помощью денситометрии для легкого ( B ) и печени ( C ).

Свойства нативной GalNAc-4-SO ₄ -специфичной и Man-специфической форм рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ отражают результаты, полученные с растворимыми химерами Fc, что позволяет предположить, что Man / GalNAc-4-SO ₄ / GalNAc-4-SO _{4 Рецептор} должен образовывать нековалентный димер для связывания LH-сефарозы с достаточной стабильностью для выделения.Кроме того, отсутствие значительных количеств димера в той части рецептора печени, которая связывается с Man-Sepharose, указывает на то, что сайты связывания Man, расположенные в CRD 4-8 (16), изолированы в GalNAc-4-SO ₄ — специфическая форма рецептора.

Количество и расположение терминала GalNAc-4-SO

Чтобы понять значение количества и расположения концевых остатков GalNAc-4-SO ₄ , мы дополнительно охарактеризовали N-связанные олигосахариды на бычьем ЛГ, гетеродимер, состоящий из α-субъединицы и β-субъединицы (23), и его отдельные субъединицы.Олигосахариды на димере LHβ, LHα и LH высвобождались путем расщепления с помощью PNGase F и дериватизировались 9-аминопирен-1,4,6-трисульфоновой кислотой (Beckman) для анализа с помощью капиллярного электрофореза (24). Одиночный N-связанный олигосахарид на LHβ состоит исключительно (99%) из сложных двухантенарных структур с двумя концевыми остатками GalNAc-4-SO ₄ (S-2), тогда как 90% олигосахаридов на двух сайтах N-связанного гликозилирования на LHα представляют собой сложные и гибридные структуры, каждая из которых содержит один концевой фрагмент GalNAc-4-SO ₄ (S-1) (E.I. Park и J.U.B., неопубликованное наблюдение) (см. Схему на рис. 4). Распределение олигосахаридов на димере LH равно сумме обнаруженных на разделенных субъединицах α и β.

Мы использовали поверхностный плазмонный резонанс для оценки связывания химерой Mu11 Fc, которая имеет два богатых Cys домена. Белок А, иммобилизованный на чипах биосенсора, использовали для захвата Mu11. Стабильный комплекс способен взаимодействовать с концевыми остатками GalNAc-4-SO ₄ на димере LHβ, LHα и LH.Кривые связывания были построены для LHβ (один S-2), LHα (два S-1) и димера LH (один S-2 и два S-1). Количество связанного в равновесии лиганда использовали для построения кривых насыщения, показанных на фиг. 3. Константы диссоциации и значения B _max определяли с помощью нелинейного регрессионного анализа, как показано в таблице 1. LHβ связывается с Mu11 в концентрации -зависимым и насыщаемым способом с K _d 2,06 × 10 ⁻⁶ M (рис. 3 A и таблица 1).Кроме того, 1,12 моль LHβ связывается на моль димерного Mu11, что указывает на то, что каждый богатый Cys домен может взаимодействовать с одним остатком GalNAc-4-SO ₄ . Это также демонстрирует, что два концевых фрагмента GalNAc-4-SO ₄ на одном олигосахариде S-2 могут соединять участки связывания GalNAc-4-SO ₄ на двух богатых Cys доменах, присутствующих в Fc-химере Mu11 . Однако LHα с двумя олигосахаридами S-1 проявляет в 10 раз лучшее сродство к Man / GalNAc-4-SO ₄ -Fc (Mu11), чем LHβ с K _d из 2.32 × 10 ⁻⁷ M (рис.3 B , таблица 1 и схема на рис.4). Мольное соотношение, полученное с LHα, указывает на то, что один GalNAc-4-SO ₄ из каждого из моносульфатированных олигосахаридов S-1 связан с каждым Cys-богатым доменом в Fc-химере. 10-кратное увеличение аффинности с LHα по сравнению с LHβ предполагает, что доступ концевых фрагментов GalNAc-4-SO ₄ к сайту связывания на каждом Cys-богатом домене значительно лучше, когда GalNAc-4-SO ₄ фрагментов присутствуют на отдельных олигосахаридных цепях.Сродство к LHα и LHβ отражает различия в пространственных отношениях концевых остатков GalNAc-4-SO ₄ , поскольку они имеют одинаковые B _max при насыщении, т. Е. Один связанный GalNAc-4-SO ₄ на Cys-богатый домен. Расстояние между фрагментами GalNAc-4-SO ₄ в двухантенарной структуре S-2 на LHβ может быть менее оптимальным или напряженным. Пространственные отношения концевых фрагментов GalNAc-4-SO ₄ в структурах S-1 и S-2 диктуются расположением этих олигосахаридов на лежащих в основе пептидах субъединиц LHα и LHβ.

Анализ связывания LHβ ( A ), LHα ( B ) и димера LH ( C ) химерой Man / GalNAc-4-SO ₄ — Fc (Mu11) с использованием поверхностного плазмонного резонанса . Химера Man / GalNAc-4-SO ₄ -Fc (Mu11) была иммобилизована на протеине-A, связанном с чипом CM5 Biacore. Увеличивающимся концентрациям димеров LHβ, LHα и LH позволяли связываться с химерой. Нелинейный регрессионный анализ полученных кривых насыщения проводился с использованием программного обеспечения призмы.Графики Скэтчарда также были построены и показаны на вставках. N — мольное отношение связанного лиганда на моль химеры Mu11 Fc, а F — концентрация лиганда. Мольные отношения определяли путем деления полученных значений единиц отклика на относительные молекулярные массы 98 128 для Man / GalNAc-4-SO ₄ -Fc (Mu11), 14 880 для LHβ, 14 607 для LHα и 29 500 для димера LH.

Связывающие свойства лигандов с различным числом концевых GalNAc-4-SO ₄ -частей для Man / GalNAc-4-SO ₄ -Fc (Mu11)

Модель для Man-специфической и GalNAc-4-SO ₄ — специфической формы рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ .Макрофаги экспрессируют преимущественно мономерную форму рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ ( Left ), показанного встроенным в липидный бислой. Man-специфические CRD 4-8 (темные квадраты) доступны для Man-несущих лигандов, тогда как мономерный Cys-богатый домен (кружки) не способен образовывать стабильные комплексы с GalNAc-4-SO ₄ -несущими лигандами. Эндотелиальные клетки печени экспрессируют преимущественно димерную форму рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ ( Right ).Сопоставление двух Cys-богатых доменов позволяет формировать стабильные комплексы с лигандами, такими как LH, несущими два или более олигосахаридов с концевыми частями GalNAc-4-SO ₄ ( верхний правый ). Показано, что рецептор взаимодействует с двумя структурами S-1 на LHα. Другие комбинации структур S-1 и S-2 могут дать такой же результат. Сайты связывания Man, обнаруженные в CRD 4-8, однако, изолированы от Man-несущих лигандов в димерной форме рецептора.

В отличие от LHα и LHβ, которые оба имеют один аффинный сайт для связывания, димер LH формирует кривую линейную диаграмму Скэтчарда (рис.3 C ), состоящий из двух или более компонентов. Регрессионный анализ дает один компонент с K _d 2,67 × 10 ^-7 M, который по существу идентичен таковому, полученному с LHα, что указывает на то, что два из четырех концевых остатков GalNAc-4-SO ₄ на Димер LH задействован. Дополнительный компонент с K _d из 8,32 × 10 ⁻⁹ M предполагает участие 3-4 частей концевого GalNAc-4-SO ₄ в димере LH при связывании с химерой Fc Иммобилизованный Mu11 на чипе Biacore.

Ингибирование связывания LHα с Mu11 за счет увеличения концентраций GalNAc-4-SO ₄ и SO ₄ -4-GalNAcβ1,4GlcNAcβ1,2Manα-MCO контролировали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Таблица 1). GalNAc-4-SO ₄ и SO ₄ -4-GalNAcβ1,4GlcNAcβ1,2Manα-MCO имеют K _i значения 16,8 × 10 ^-5 M и 1,20 × 10 ^-5 M, соответственно. Таким образом, богатый Cys домен распознает почти исключительно концевой сульфатированный моносахарид.Основная структура олигосахарида не вносит значительного вклада в связывание концевого GalNAc-4-SO ₄ .

Обсуждение

Быстрый выведение нативного (сульфатированного), но не рекомбинантного (сиалилированного) бычьего ЛГ из кровотока привело нас к идентификации рецептора, специфичного для терминального GalNAc-4-SO ₄ (6) (см. Рис. 4). Мы выделили рецептор, ответственный за выведение ЛГ из кровотока эндотелиальными клетками печени (5).Каждая эндотелиальная клетка способна связывать 5,7 × 10 ⁵ молекул ЛГ с K _d 1,63 × 10 ^-7 M (5). Кроме того, рецептор различает SO ₄ -4-GalNAcβ1,4GlcNAcβ1,2Manα-BSA и SO ₄ -3-GalNAcβ1,4GlcNAcβ1,2Manα-BSA, что указывает на то, что положение концевого сульфата имеет решающее значение для связывания и клиренса. из тиража (5).

GalNAc-4-SO ₄ -специфический рецептор был выделен из печени крысы и, как было установлено, имеет ту же аминокислотную последовательность, что и Man-специфический рецептор, выделенный из альвеолярных макрофагов (11).Две формы рецептора различаются по своим свойствам связывания лиганда. Специфическая для GalNAc-4-SO ₄ форма не связывается с иммобилизованным человеком, тогда как специфическая для человека форма не связывает иммобилизованные гликопротеины, несущие олигосахариды, оканчивающиеся на GalNAc-4-SO ₄ . Однако клетки СНО могут экспрессировать рекомбинантные рецепторы, которые связывают и интернализируют гликопротеины, несущие либо концевой Man, либо концевой GalNAc-4-SO ₄ (12). Это предполагает, что посттрансляционные события регулируют специфичность рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ .Различная специфичность двух форм рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ дополнительно указывает на то, что этот рецептор выполняет несколько функций. Эти функции отражают как лигандную специфичность рецептора, так и его сайт-специфическую экспрессию в разных клетках. Рецептор в эндотелиальных клетках печени, который удаляет из крови лиганды, несущие GalNAc-4-SO ₄ , должен иметь одну или несколько структурных особенностей, которые отличают его от того же рецептора, экспрессируемого в макрофагах, который связывает лиганды с конечным человеком.

Основываясь на свойствах рецептора in vivo и свойств Fc-химер, мы предполагаем, что рецептор Man / GalNAc-4-SO ₄ существует как в виде мономера, так и в виде гомодимера. Как показано на рис. 4, наши данные показывают, что мономерная форма рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ является Man-специфической, а димерная форма является GalNAc-4-SO ₄ -специфичной. Как Man-специфическая, так и GalNAc-4-SO ₄ -специфическая формы рецептора присутствуют в эндотелиальных клетках печени, что позволяет предположить, что они находятся в равновесии друг с другом.Напротив, мы обнаруживаем только Man-специфическую форму в альвеолярных макрофагах, что согласуется с возможностью того, что рецептор Man / GalNAc-4-SO ₄ в макрофагах не может образовывать гомодимер in vivo . Различные паттерны гликозилирования или других посттрансляционных модификаций в макрофагах и эндотелиальных клетках печени могут определять, способен ли рецептор образовывать димер in vivo . Различия в подвижности рецептора, выделенного из печени и легких (рис.2) согласуются с этой возможностью. В настоящее время мы исследуем молекулярную основу, определяющую, какая форма рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ экспрессируется конкретной клеткой.

Наши предыдущие исследования продемонстрировали, что богатый Cys домен необходим и достаточен для связывания GalNAc-4-SO ₄ , тогда как CRD 4-8 отвечают за связывание лигандов, заканчивающихся Man, GlcNAc или фукозой (18). Модель на рис.4 обеспечивает структурную основу для различий между GalNAc-4-SO ₄ — и специфическими для человека формами рецептора, которые могут объяснить тот факт, что области, связывающие GalNAc-4-SO ₄ и Человек физически различны.Текущие исследования показывают, что для образования стабильных комплексов с иммобилизованными лигандами, несущими несколько концевых частей GalNAc-4-SO ₄ , требуются два богатых Cys домена. Кроме того, ≥62% рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ в эндотелиальных клетках печени присутствует в форме гомодимера, поскольку мономерная форма не связывается с ЛГ.

Мы показали, что 93% рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ в легких является мономерным на основании как его неспособности связываться с LH-сефарозой, так и отсутствия димерных частиц во время анализа с помощью SDS / PAGE.Доминирование мономерного рецептора в легких поддерживает наше предположение о том, что рецептор, экспрессируемый макрофагами, не может образовывать димерные виды. Более того, отсутствие димера в рецепторе, связанном с Man-Sepharose из печени, указывает на то, что CRD 4-8 действительно секвестированы в димерной форме и препятствуют доступу к иммобилизованным остаткам Man. Мономерные виды в печени могут отражать либо присутствие рецептора, который не может образовывать гомодимеры, либо мономеры, находящиеся в равновесии с димерами.

Рецептор Man / GalNAc-4-SO ₄ примечателен тем, что его две специфичности в отношении лигандов, несущих GalNAc-4-SO ₄ , и лигандов, несущих человек, являются взаимоисключающими. Доминирование мономерного рецептора в макрофаге, где доступны CRD 4-8, может отражать его предполагаемую роль в качестве фагоцитарного рецептора в врожденном иммунитете (25). Димерный GalNAc-4-SO ₄ -специфический рецептор в эндотелиальных клетках необходим для контроля уровней ЛГ и ТТГ в кровотоке (5, 6, 26).Присутствие этих альтернативных форм в различных тканях указывает на то, что экспрессия регулируется клеточно-специфическим образом.

Гликопротеиновые гормоны ЛГ и ТТГ в настоящее время являются единственными хорошо зарекомендовавшими себя нативными лигандами для GalNAc-4-SO ₄ -специфической формы рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ . Оба гормона несут несколько олигосахаридов, заканчивающихся одним или несколькими фрагментами GalNAc-4-SO ₄ . Их пространственные отношения имеют решающее значение для связывания, потому что присутствие двух олигосахаридов S-1 позволяет LHα связываться с K _d из 2.32 × 10 ^-7 M, тогда как единственный олигосахарид S-2 на LHβ связывается с аффинностью в 10 раз ниже. Стехиометрия связывания указывает на то, что каждый богатый Cys доменом взаимодействует с одним GalNAc-4-SO ₄ . Это согласуется с недавним кристаллографическим исследованием, в котором был идентифицирован единственный сайт связывания (27), и с исследованиями равновесного диализа (неопубликованная работа). Очевидно, что взаимосвязь концевых остатков GalNAc-4-SO ₄ в пространстве оказывает большое влияние на их способность связываться одновременно с двумя богатыми Cys доменами.Наши данные показывают, что только определенные формы нативного рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ , такие как тот, который присутствует в эндотелиальных клетках печени, образуют стабильные димерные структуры.

LH связывается изолированными эндотелиальными клетками печени с кажущимся K _d 1,63 × 10 ⁻⁷ M (5), значение почти идентично K _d 2,67 × 10 ^−7. M получено для связывания LHα через две концевые группы GalNAc-4-SO ₄ на отдельных олигосахаридах с химерой Fc, иммобилизованной на чипе Biacore.Это предполагает, что ЛГ связывается с димерной, GalNAc-4-SO ₄ -специфической формой рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ на поверхности эндотелиальных клеток, используя только два из его 3-4-концевых GalNAc- 4-СО ₄ -множеств. Даже несмотря на то, что димер LH может связываться с рекомбинантной химерой Mu11, иммобилизованной на чипе Biacore с дополнительным компонентом K _d 8,3 × 10 ⁻⁹ M при взаимодействии с 3–4-концевым GalNAc-4-SO ₄ фрагментов, этот последний компонент с высоким сродством не наблюдается, когда LH связывается с рецептором на поверхности эндотелиальных клеток печени in vivo .

На основании исследований связывания, проведенных с рекомбинантным рецептором Simpson et al. (28) предположили, что гликопротеиновые гормоны также могут связываться с рецептором Man / GalNAc-4-SO ₄ через остатки Man отдельно или в комбинации с GalNAc-4-SO ₄ . Бычий ЛГ действительно содержит концевые остатки Man, что обусловлено наличием гибридных структур (1, 2). Simpson et al. (28) сообщил, что ЛГ связывается с Man-специфическими сайтами рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ со сродством в диапазоне 2.8 × 10 ⁻⁶ M (28). В свете K _d 2,32 × 10 ^-7 M, полученного при взаимодействии двух фрагментов GalNAc-4-SO ₄ , кажется маловероятным, что взаимодействие с концевыми остатками Man способствует клиренсу LH в vivo . Секвестрация Man-связывающих доменов в димерной, GalNAc-4-SO ₄ -специфической форме рецептора делает взаимодействие с концевыми остатками Man на LH еще менее вероятным. Способность нативного рецептора GalNAc-4-SO ₄ из печени связывать ЛГ не изменяется присутствием человека, и мы не смогли продемонстрировать одновременное взаимодействие с человеком и GalNAc-4-SO ₄ для любого человека. рецептор из легких или рецептор GalNAc-4-SO ₄ из печени (D.Fiete and J.U.B., неопубликованное наблюдение). ЛГ и ТТГ от других видов животных не несут терминальный Man или GlcNAc в той же степени, что и бычий гормон, хотя они несут терминальный GalNAc-4-SO ₄ (1, 2). Напротив, присутствие концевого β1,4-связанного GalNAc-4-SO ₄ на N-связанных олигосахаридах гликопротеиновых гормонов было законсервировано у всех видов позвоночных, что указывает на критическую роль этих структур in vivo (8 ). Несмотря на то, что одновременное связывание с концевым Man и GalNAc-4-SO ₄ на бычьем ЛГ при некоторых обстоятельствах возможно, эта форма связывания также вряд ли будет способствовать клиренсу ЛГ и ТТГ печеночным Man / GalNAc-4- SO ₄ рецептор in vivo .

Наши результаты показывают, что форма рецептора Man / GalNAc-4-SO ₄ , экспрессируемого эндотелиальными клетками по сравнению с макрофагами, строго регулируется. Кроме того, мы предоставили молекулярную основу того, как количество концевых остатков GalNAc-4-SO ₄ на LH и TSH контролирует их период полураспада в кровотоке. Присутствия двух или более концевых остатков GalNAc-4-SO ₄ на отдельных олигосахаридах достаточно для обеспечения продуктивного связывания рецептором Man / GalNAc-4-SO ₄ на эндотелиальных клетках печени.Поскольку рецептор является димерным на эндотелиальных клетках и постоянно интернализуется, дополнительные остатки концевых GalNAc-4-SO ₄ , присутствующие на нативном LH, вряд ли будут способствовать связыванию in vivo . Скорость ассоциации и концентрация ЛГ в крови будут определять, какая часть рецептора занята во время интернализации. Большое количество рецептора, экспрессируемого эндотелиальными клетками печени, гарантирует, что скорость выведения из кровотока за счет интернализации будет оставаться постоянной в широком диапазоне концентраций ЛГ, обеспечивая максимальную активацию рецептора ЛГ в яичниках и семенниках.

Благодарности

Мы благодарим Нэнси Баензигер, Джереми Кеуша и Элисон Вудворт за критические комментарии. Работа поддержана грантами R37-CA21923 и R01-DK41738 Национальных институтов здравоохранения.

Сноски

• ↵ * Кому следует обращаться с запросами на перепечатку. Электронная почта: Baenziger {at} Pathology.wustl.edu.

• Этот документ был отправлен напрямую (Трек II) в офис PNAS.

• Статья перед печатью опубликована на сайте: Proc. Natl. Акад. Sci. USA , 10.1073 / pnas.170184597.

• Статья и дата публикации находятся на сайте www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.170184597

Сокращения

CHO,

яичник китайского хомячка;

Man,

манноза;

LH,

лутропин;

ФСГ,

фоллитропин;

ТТГ,

тиреотропин;

CRD,

домен распознавания углеводов C-типа

• Copyright © Национальная академия наук

Арбускулярный микоризный симбиоз вызывает протеомные реакции, противоположные P-голоданию в подвое виноградной лозы SO4 при колонизации корней двумя видами Glomus

Abel S, Ticconi CA, Delatorre CA (2002) Фосфатное зондирование у высших растений.Physiol Plant 115: 1–8

PubMed CAS Google Scholar

PEM® SO4 | Самозажимные стойки с резьбой | Клинч | Клинчинговая техника | Особые технологии крепления | Продукты