Пцр днк диагностика что это: что это такое и что показывает, как делается и сколько стоит исследование?

Содержание

Что такое ПЦР: плюсы и минусы PCR

Сколько стоит сдать ПЦР-анализ

Я пять лет работал в государственной медицинской лаборатории.

По опыту знаю, что пациентам бывает непросто разобраться с тем, какие тесты им нужно сдавать, да и нужно ли вообще. В этой статье расскажу, что такое ПЦР-анализы и можно ли на них сэкономить.

Даниил Давыдов

разобрался с анализами

Сходите к врачу

Наши статьи написаны с любовью к доказательной медицине. Мы ссылаемся на авторитетные источники и ходим за комментариями к докторам с хорошей репутацией. Но помните: ответственность за ваше здоровье лежит на вас и на лечащем враче. Мы не выписываем рецептов, мы даем рекомендации. Полагаться на нашу точку зрения или нет — решать вам.

Что такое ПЦР-тесты и зачем их сдавать

Полимеразная цепная реакция — метод, позволяющий обнаружить конкретный генетический материал в образце. В качестве образца можно взять почти что угодно: от анализа крови пациента до древних костей или окурков из пепельницы на лестничной площадке. Например, сотрудники криминалистических лабораторий применяют ПЦР-тест, чтобы по частичкам ДНК с места преступления установить личность преступника или его жертвы. Это почти как отпечатки пальцев, только не рук, а генетического материала.

Статья про ПЦР-анализы в криминалистике

В отличие от криминалистов, врачей обычно интересуют две вещи:

  1. «Личность» микроскопических преступников — вирусов и бактерий, которые вызвали заболевание у пациента.
  2. Особенности строения генома пациента — например, у людей с лейкозами при помощи ПЦР-тестов определяют мутации гена MPL.

Зачем врачам ПЦР: статья в Elsevier Public Health Emergency Collection

Но генетические анализы нужны не так уж часто, поэтому в статье мы будем говорить про ПЦР-анализы на инфекции.

Как работает ПЦР-анализ. У большинства живых существ на нашей планете, за исключением некоторых вирусов с РНК-геномами, генетический материал представляет собой длинную двухцепочечную молекулу ДНК.

Цепочка ДНК состоит из «звеньев» — нуклеотидов. Это четыре небольшие молекулы, строение которых универсально для всех живых существ. Из одного и того же набора нуклеотидов можно собрать геном вируса оспы, человека или синего кита. Вся разница — в порядке, в котором нуклеотиды идут в цепочке ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов для участка ДНК какой-нибудь болезнетворной бактерии, мы можем засечь его присутствие в биологическом материале. А поскольку этот порядок уникален, мы не перепутаем его с человеческой ДНК.

Сколько стоит сдать генетический тест

Во время полимеразной цепной реакции кусочек чужеродного генетического материала из образца при помощи особого белка-фермента размножают много-много раз. В результате получается столько ДНК, что ее хватает для успешной идентификации.

Подробнее о том, как работает ПЦР — 12 биометодов в картинках: полимеразная цепная реакция

Для каждого микроорганизма набор реактивов нужен свой. Поэтому врачи назначают не ПЦР-анализ вообще, а исследование на конкретный микроорганизм. Так что ПЦР-тест на гепатит С не поможет найти в образце еще и хламидии.

ПЦР-анализы бывают качественные и количественные. Качественные позволяют понять, есть ли в образце генетический материал бактерии или вируса, который мы ищем. А количественные — сколько именно там этого материала. Если сделать несколько таких тестов во время лечения, станет ясно, действует ли на микробов назначенное лекарство.

Как подготовиться к ПЦР-анализу

Чтобы выяснить, какая инфекция поразила человека, у него обычно берут кровь, мочу, образцы клеток слизистой из ротоглотки или с шейки матки.

В России кровь по умолчанию рекомендуется сдавать натощак, не менее чем с интервалом в 8—12 часов после приема пищи. Однако за рубежом таких строгих правил нет: считается, что перед походом в лабораторию можно позавтракать без сладкого и жирного, например кашей без сахара и масла, куриной грудкой или яйцом. Так что если у вас был легкий завтрак, кровь сдавать можно. Пить тоже не запрещено, но лучше ограничиться чистой водой без газа.

Если врач назначил мазок из горла на ПЦР-анализ, за три часа до процедуры нельзя есть, чистить зубы, полоскать рот и рассасывать любые таблетки. Непосредственно перед взятием мазка не стоит жевать жевательную резинку. Если нос заложен, перед процедурой нужно как следует высморкаться.

Правила, по которым нужно сдавать мазок на ПЦР из половых органов, отличаются для мужчин и для женщин. Всем за 1—2 дня до исследования нужно отказаться от секса, а в течение 1,5—2 часов перед исследованием — воздерживаться от мочеиспускания. Женщинам за сутки до процедуры не следует проводить спринцевание, пользоваться свечами и антисептиками для подмывания. Во время менструации сдавать биологический материал нельзя.

Можно ли верить ПЦР-тесту

Ни один лабораторный тест не обеспечивает абсолютной точности, всегда есть вероятность ошибки. Причем ошибиться тест может в обе стороны: либо не найти искомую инфекцию у пациента, которой он на самом деле заражен, либо обнаружить ее у человека, болеющего чем-то другим или вовсе здорового.

При этом ПЦР-анализы зачастую точнее других методов поиска возбудителя инфекционных заболеваний. Например, возбудителей гонореи у женщин можно искать под микроскопом, можно выращивать в чашке Петри, а можно определять методом ПЦР. В первом случае чувствительность анализа в пределах 36,2%, во втором — 89,7%, а в третьем — 89,9—100%. Получается, что ПЦР-анализ — самый надежный, и доверять ему можно. Примерно так же дела обстоят и с другими половыми инфекциями.

Информативность ПЦР в диагностике инфекций, передаваемых половым путемPDF, 152 КБ

Но здесь многое зависит от времени взятия образца. Если мазок из горла взяли через 3—4 дня после появления симптомов, то вирус уже мог успеть спуститься из ротоглотки в легкие, и тогда вероятность найти его в мазке составляет всего 40%.

Хотя ПЦР-тесты на коронавирус работают хуже, чем ПЦР-тесты на половые инфекции, ничего точнее для диагностики коронавирусной болезни у нас пока нет. Врачи назначают повторный тест, если у них по результатам диагностики остаются сомнения.

Как сдать анализы на коронавирусную инфекцию

Как лечиться экономно

Или не платить за лечение вообще. Расскажем в нашей рассылке вместе с другими материалами о деньгах

О чем говорят результаты ПЦР-анализа

Проще всего разобраться с результатами качественных анализов: они могут быть либо положительными, либо отрицательными. Если результат положительный — значит, скорее всего, возбудитель в организме есть. Если отрицательный — скорее всего, его нет.

С результатами количественного ПЦР-анализа разобраться сложнее. Чтобы сказать, помогает ли лечение, нужно сделать несколько анализов — с интервалом от 2—3 дней до нескольких месяцев. Сравнивая старый и свежий результат, врач видит, что происходит с бактериями или вирусами в организме: становится ли их больше или, наоборот, меньше.

Если сделать всего один анализ, польза от количественного теста будет невелика: при положительном результате мы узнаем лишь то, что инфекция в организме действительно есть.

На этом бланке представлены результаты качественного и количественного теста на гепатит С — оба говорят, что вирус в организме есть. Через некоторое время после начала лечения нужно будет сделать повторный количественный анализ на гепатит С. Если концентрация вируса в биоматериале уменьшится, значит, лечение помогает. Фото: nuzdkp.ruНа этом бланке представлены результаты качественного и количественного теста на гепатит С — оба говорят, что вирус в организме есть. Через некоторое время после начала лечения нужно будет сделать повторный количественный анализ на гепатит С. Если концентрация вируса в биоматериале уменьшится, значит, лечение помогает. Фото: nuzdkp.ru

Чем заменить ПЦР-анализ — и можно ли так делать

Это зависит и от конкретного микроорганизма, и от типа анализа, который вам нужно сдать. Например, возбудителя урогенитального микоплазмоза — бактерию Mycoplasma genitalium — можно обнаружить только методом ПЦР. А возбудителя хламидиоза — Chlamydia trachomatis — удастся найти еще и методами иммуноферментного анализа (ИФА), прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) и культуральным посевом (КП). Иногда анализ, проведенный другим методом, обходится дешевле, но может либо занять больше времени, либо оказаться менее точным.

Если вам надо сдать качественный анализ на возбудителя какого-либо заболевания, можно обсудить замену метода с врачом. Самостоятельно менять ПЦР-тест на, скажем, ИФА-тест не стоит: точность разных лабораторных методик может сильно различаться. Не исключено, что в вашем случае анализ методом ПЦР даст наилучший результат.

На этом бланке представлены результаты качественного и количественного теста на гепатит С — оба говорят, что вирус в организме есть. Через некоторое время после начала лечения нужно будет сделать повторный количественный анализ на гепатит С. Если концентрация вируса в биоматериале уменьшится, значит, лечение помогает. Фото: nuzdkp.ru

Что закон говорит о врачах

Что касается количественных анализов, то в большинстве случаев имеет смысл сдать именно тот тест, который рекомендует врач. От точности количественного анализа зачастую зависит результат лечения.

Какие ПЦР-анализы можно сдать бесплатно

Если нужный вам анализ есть в стандарте лечения заболевания, а само заболевание входит в базовую — действующую по всей стране — или в территориальную программу ОМС, то этот анализ вам должны сделать бесплатно. Но на практике возможны нюансы.

Например, в лаборатории может не оказаться нужных реактивов — и тогда результатов придется ждать гораздо дольше, чем если бы вы сдавали анализы в частной лаборатории. Поэтому иногда, если время дорого, стоит сдать анализ платно.

На этом бланке представлены результаты качественного и количественного теста на гепатит С — оба говорят, что вирус в организме есть. Через некоторое время после начала лечения нужно будет сделать повторный количественный анализ на гепатит С. Если концентрация вируса в биоматериале уменьшится, значит, лечение помогает. Фото: nuzdkp.ru

Вы имеете право на бесплатные анализы по ОМС

Сколько стоит ПЦР-анализ

Цена ПЦР-анализа зависит от нескольких параметров.

Методики ПЦР, которую применяют в конкретной лаборатории. Например, в LabQuest для качественного определения вируса гепатита С применяют ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) — это стоит 2780 Р. А в List Lab используют классический ПЦР-тест за 520 Р.

ПЦР в реальном времени предназначена для количественных тестов, но ее можно применять и для качественных анализов — правда, получится дороже, а разницы с более дешевым классическим вариантом ПЦР не будет.

Количества анализов, которые вы собираетесь сдавать. Например, в лаборатории «Инвитро» выявление возбудителей ИППП 7 типов методом ПЦР в мазке обойдется в 3100 Р, а определение одних только хламидий — в 835 Р.

Типа анализов. Реактивы для количественных ПЦР-тестов более дорогие, а методика сложнее, так что количественные тесты дороже качественных. Например, в лаборатории «Ситилаб» качественный ПЦР-анализ на гепатит С обойдется в 720 Р, а количественный — в 3100 Р.

3100 Р

стоит количественный анализ на гепатит С 

Вида микроорганизма, который нужно обнаружить. Например, в лаборатории LabQuest анализ на коронавирусную инфекцию обойдется в 2500 Р, а анализ на возбудителя гонореи — в 360 Р.

Чтобы сравнить цены в разных клиниках, мы выбрали один анализ — на гепатит С, для которого берут кровь из вены. Цены указаны с учетом взятия крови.

Где сдать платный ПЦР-анализ на гепатит С

Цена с учетом забора крови

3625 Р

Сроки

5 календарных дней

Цена с учетом забора крови

2975 Р

Сроки

8 календарных дней

Цена с учетом забора крови

3430 Р

Сроки

5 рабочих дней

Цена с учетом забора крови

700 Р

Сроки

4 рабочих дня

Цена с учетом забора крови

3300 Р

Сроки

5 рабочих дней

Цена с учетом забора крови

920 Р

Сроки

5 рабочих дней

Цена с учетом забора крови

3220 Р

Сроки

1 рабочий день

Цена с учетом забора крови

985 Р

Сроки

1 рабочий день

Запомнить

  1. ПЦР-тесты помогают обнаружить фрагменты генетического материала бактерий, вирусов или других людей. Но для каждого микроорганизма реактив нужен свой, так что универсальных тестов ПЦР на все инфекции сразу не бывает.
  2. Подготовка к анализу зависит от того, какой биологический материал вы сдаете. Если кровь, то особо готовиться не надо. Для других материалов есть несложные правила — если их соблюдать, анализ будет точнее.
  3. Если вам назначили качественный ПЦР-анализ, имеет смысл сдавать его или в государственной лаборатории (если обследование положено по ОМС), или в частной, где окажутся подходящие цены.
  4. Если вам назначили количественный ПЦР-анализ, врач напишет в направлении не только название исследования, но и предпочтительный метод, которым нужно провести ПЦР-анализ. Если указания на метод нет — выбирайте ту лабораторию, цены в которой вас устраивают.
Как распознать незримых для глаз врагов? С помощью ПЦР-диагностики

 

В нашем теле обитают миллионы микроорганизмов. И далеко не все из них миролюбивые. Как распознать незримых для глаз врагов, особенно если речь идет о возбудителях опасных заболеваний? На помощь приходит диагностика на уровне ДНК. Результаты анализа можно узнать уже через 3-4 часа после обращения. За изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР), на которой основано выявление вида любого живого организма, американский ученый Кэрри Мюллис был удостоен Нобелевской премии.

Полимеразная цепная реакция

 

 

 

Новое открытие

В 70-х годах двадцатого века были открыты ферменты, расщепляющие ДНК в специфических точках. Исследователи получили возможность «разрезать» ДНК на более короткие и стабильные фрагменты.

После этого последовало новое открытие: ученые «научили» ДНК копировать саму себя и достраивать до таких размеров, которые легко опознать. Фактически это позволило идентифицировать по выделенному фрагменту ДНК любой интересующий объект:

  • вот — ДНК возбудителя насморка,
  • это — стафилококка,
  • это — вируса герпеса.

В качестве материала для анализа можно использовать:

  • пробу ткани пациента,
  • одиночный человеческий волос,
  • каплю засохшей крови (обнаруженную на месте преступления),
  • мозг мумии.

Даже тело мамонта, пролежавшего 40 тыл. лет в вечной мерзлоте, сможет рассказать, чем болел доисторический гигант.

Все больше и больше специалистов рекомендуют ПЦР-диагностику вместо обычных бактериологических анализов. В первую очередь это урологи и гинекологи — в их сфере плюсы метода ценятся особенно высоко.

Быстро и с гарантией выявляются все зловредные возбудители урогенитальных инфекций:

  • хламидиоза,
  • уреаплазмоза,
  • гонореи,
  • герпеса,
  • гарднереллеза,
  • микоплазменной инфекции и др.

Взяли на вооружение новый метод и пульмонологи (врачи, которые занимаются заболеваниями легких), ведь он позволяет различать вирусные и бактериальные пневмонии, туберкулез. В гематологии ДНК-диагностика выявляет цитомегаловирусы, онковирусы. Ну и, конечно же, не остались в стороне врачи-инфекционисты:

ПЦР используется в качестве экспресс-метода диагностики:

  • сальмонеллеза,
  • дифтерии,
  • вирусных гепатитов В, С и G.

 

ПЦР-диагностика: много плюсов и один большой минус

 

Преимущества метода:

— Возбудитель выявляется непосредственно, по специфическому участку ДНК, в отличие от иммуноферментного анализа, при котором вредный микроб выявляется косвенно (по особым белкам — продуктам его жизнедеятельности).

— Возможна четкая идентификация ДНК одного определенного возбудителя. Метод позволяет не спутать его ни с каким другим, как это бывает в том же иммуноферментном анализе, где антигены нескольких микроорганизмов нередко реагируют перекрестно.

— Метод может выявить даже одну-единственную болезнетворную бактерию среди миллиардов других и через несколько часов предоставить 50 миллиардов ее копий! То есть он работает там, где другие методы (микроскопический, бактериологический, иммуноферментный) пасуют.

Метод универсален. Ведь все на свете ДНК состоят из тех же четырех нуклеотидов:

  • аденина (А),
  • гуанина (Г),
  • цитозина (Ц),
  • тимина (Т).

Поэтому способ применим абсолютно для любых бактерий и вирусов. Причем обнаружить можно не только кого угодно, но и где угодно в:

  • крови,
  • моче,
  • мокроте,
  • биоптате (маленький кусочек ткани),
  • почве.

Результаты анализа можно получить чрезвычайно быстро, ведь возбудителя не надо выращивать искусственно (именно эта процедура при лабораторном исследовании занимает много времени). Ответ, как правило, готов уже через 3-4 часа после обращения.

 

Один недостаток — сверхчувствительность

Как это часто бывает, достоинства метода иногда становятся и его недостатками. Речь идет о феноменальной чувствительности ПЦР, которая может оборачиваться «ложноположительными» результатами, если в посуде, пипетках и прочем оборудовании для анализа будет хотя бы крошечное количество «чужеродной» ДНК. ПЦР размножит эту ДНК и выдаст неправильный результат.

Но эта проблема решаема — посуда и материалы должны быть одноразовыми, а амплификацию (многократное копирование) ДНК необходимо проводить в отдельном от подготовки проб помещении. Именно поэтому доверять результатам ПЦР-диагностики можно, если вы обратились в солидную лабораторию, оснащенную по последнему слову техники.

Все самое интересное на главной странице

что это, методы, особенности, область применения

Расшифровка генома человека стала настоящим прорывом ХХ века: мир узнал о том, как заложенный «код» влияет на каждого из нас. И пусть ученые до сих пор ведут споры вокруг этой темы, мы уже можем оценить результаты многолетних исследований: любому человеку стала доступна молекулярно-генетическая диагностика.

Как узнать свой личный «код» и для чего это нужно? Об этом мы расскажем в данной статье.


Что такое молекулярно-генетическая диагностика

Итак, молекулярно-генетическая диагностика — сравнительно новый метод обследования организма, позволяющий точно и быстро выявить вирусы и инфекции, мутации генов, вызывающих патологию, оценить риски наследственных и иных заболеваний. И это далеко не полный спектр возможностей исследования ДНК.

Важнейшим достоинством молекулярно-генетической диагностики является минимальная степень медицинского вмешательства, поскольку исследование проводят in vitro. Метод успешно применяют даже для диагностики заболеваний у эмбрионов, а также у ослабленных и тяжелобольных пациентов. Самый распространенный материал для исследования — кровь из вены, однако возможно выделение ДНК/РНК из других жидкостей и тканей: слюны, соскоба слизистой рта, выделений из половых органов, околоплодной жидкости, волос, ногтей и т.д.

Молекулярная диагностика — значительный шаг к персонализированной медицине, она позволяет учитывать все особенности конкретного пациента при обследовании и терапии.

Области медицинского применения методов молекулярной диагностики

Итак, исследование ДНК/РНК используется во многих разделах медицины. Давайте рассмотрим задачи и области, в которых активно применяют молекулярную диагностику:

  • Выявление существующих патологий. Например, к молекулярной диагностике прибегают в тех случаях, когда инфекционное или вирусное заболевание не может быть определено обычными методами. Она позволяет обнаружить болезнь даже на ранней стадии, когда внешних проявлений нет.
  • Исследование аллергических реакций. Молекулярная диагностика успешно применяется для определения аллергии: в отличие от традиционных методов, она более точна и при этом безопасна для пациента, так как отсутствует непосредственный контакт с аллергеном.
  • Индивидуальная оценка рисков развития наследственных заболеваний. Молекулярная диагностика помогает выявить у взрослых и детей опасность в будущем подвергнуться различным патологиям. Нужно отметить, что есть болезни, которые вызваны исключительно мутацией гена (моногенные) и те, которые обусловлены в том числе генетическими особенностями (мультифакторные). Информация о первых позволяет, к примеру, оценить риски передачи наследственных заболеваний от родителей к ребенку. Знание о предрасположенности к мультифакторной патологии необходимо еще и для профилактики болезней с помощью изменения образа жизни.
  • Перинатальная медицина. Как уже было сказано, молекулярная диагностика способна дать информацию о состоянии здоровья и генетических предрасположенностях человека. Это относится и к эмбрионам: анализ ДНК еще не родившегося ребенка позволяет распознать синдромы Дауна, Эдвардса, Патау, Тернера, Клайнфельтера. Также молекулярная диагностика применяется в области вспомогательных репродуктивных технологий: она позволяет установить генетические причины бесплодия и невынашивания беременности.
  • Фармакогенетика. Молекулярная диагностика объясняет, почему на некоторых действуют одни препараты, а на других — иные: все дело в генетических особенностях пациентов. Возможность определения эффективности веществ имеет особое значение при лечении тяжелых заболеваний, например, онкологических.
  • Спортивная медицина. Настоящие чудеса исследования ДНК и РНК творят и в области оценки спортивных перспектив. Например, родители малышей могут узнать о том, какой вид занятий принесет ребенку наибольшую пользу для здоровья или позволит достичь спортивных результатов.

На заметку
В США побочные воздействия лекарств входят в пятерку самых распространенных причин госпитализации и смерти, а устранение ПВЛ обходится дороже, чем само лечение. Медики возлагают большие надежды на молекулярную диагностику: индивидуальный подбор препаратов с учетом генетических особенностей каждого (персонализированная терапия) должен решить эту проблему.


Когда проводится генетическое исследование

Итак, обращение к генетическим исследованиям актуально в тех случаях, когда пациент стремится получить сведения о состоянии своего организма. Обычно это необходимо в следующих ситуациях:

  • для постановки точного диагноза. Например, очень распространенным является неверное определение аллергена либо несвоевременная диагностика вирусного заболевания. Между тем от этого зависит успешность лечения;
  • для профилактики возможных патологий. Если пациенту известно о повышенном риске сердечно-сосудистых заболеваний или рака, он может предпринимать соответствующие меры, например, отказаться от вредных привычек;
  • для повышения эффективности лечения. К примеру, онкозаболевания имеют множество вариантов терапии. Выбор тактики лечения «методом проб и ошибок» приводит к потере драгоценного времени и здоровья, а иногда — и к летальному исходу;

Отдельной группой стоит выделить исследования ДНК, которые проводят в связи с планированием или рождением ребенка. Чаще всего родители обращаются в лабораторию, чтобы:

  • изучить свою генетическую совместимость, оценить риски наследственных заболеваний потомства;
  • исследовать состояние плода, выявить синдромы и опасные патологии;
  • диагностировать заболевания (и оценить риски) и аллергические реакции у малыша;
  • определить, какие спортивные занятия, какое питание и образ жизни будут наиболее полезны для ребенка, а чего стоит избегать;
  • установить отцовство или материнство.

Этапы исследования

Независимо от выбранного метода молекулярно-генетического исследования, оно будет включать в себя следующие этапы:

  • взятие биоматериала. Как уже было сказано, чаще для исследования используют кровь пациента. Полученный материал маркируют и транспортируют в лабораторию;
  • выделение ДНК/РНК;
  • проведение исследований в соответствии с выбранным методом;
  • изучение и интерпретацию результатов;
  • выдачу заключения.

Методы молекулярно-генетической диагностики

Методы молекулярной цитогенетики

Цитогенетический анализ позволяет выявить наследственные заболевания, психические отклонения, врожденные пороки развития. Суть метода — в изучении хромосом с помощью специальных микроматриц, нанесенных на ДНК-чипы. Для этого из образца крови выделяют лимфоциты, которые затем помещают на 48–72 часа в питательную среду и по истечении этого времени исследуют. Назначают такой анализ нечасто, в основном для изучения причин бесплодия и невынашивания беременности, для уточнения диагноза у детей при подозрении на врожденные заболевания. Анализ очень точен, но достаточно трудоемок и длителен (результат можно получить лишь через 20–30 дней после сдачи).

Достоинство и в то же время недостаток метода — в его специфичности: цитогенетика может выявить лишь небольшое количество патологий (например, аутизм), однако делает это практически без погрешностей.

Молекулярная диагностика методом ПЦР

Полимеразная цепная реакция — метод, изобретенный в 1983 году, по сей день самый популярный и фундаментальный в молекулярной диагностике. Характеризуется высочайшей точностью и чувствительностью, а также скоростью проведения исследования. Молекулярная диагностика ДНК/РНК методом ПЦР позволяет выявить такие патологии, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие.

Для анализа выбирают участок ДНК и многократно дублируют его в лаборатории с помощью специальных веществ. Для диагностики подходит большой перечень биоматериалов: кровь, слюна, моча, выделения из половых органов, плевральная и спинномозговая жидкость, ткани плаценты и т.д.

Метод флуоресцентной гибридизации (FISH)

В данном молекулярном методе объектом исследования становятся уникальные нуклеотидные соединения отдельно взятой хромосомы или ее участок. Для этого используются меченые флуоресцентными маркерами короткие ДНК-последовательности (зонды), которые позволяют выявить фрагменты с атипичными генами. Биоматериал для анализа может быть любой: кровь, костный мозг, плацента, ткани эмбриона, биопсия и т.д. Важно, чтобы образец был доставлен в лабораторию сразу после его изъятия.

Метод особенно активно используют в онкологии (например, для наблюдения за остаточными злокачественными клетками после химиотерапии), а также в пренатальной диагностике (для определения риска развития у плода врожденных пороков), гематологии. FISH-метод очень чувствителен и точен для выявления поврежденных фрагментов ДНК (погрешность около 0,5%), при этом достаточно быстр: результат придется ждать не более 72-х часов. Однако у него есть и недостатки: FISH еще более специфичен, чем микроматричный цитогенетический анализ, и может служить лишь для подтверждения или опровержения предполагаемого диагноза.

Микрочипирование

Этот метод похож на предыдущий — здесь так же используются меченные флуоресцентом последовательности ДНК. Однако эти зонды сначала выделяют из проб, полученных от пациента, и затем сравнивают с образцами, нанесенными на микрочипы. ДНК-микрочип представляет собой основание (стеклянное, пластиковое, гелевое), на которое может быть нанесено до нескольких тысяч микротестов длиной от 25 до 1000 нуклеотидов. Полученные после очистки биоматериала пробы (зонды) совмещают с микротестами на чипе и наблюдают за реакцией маркёров. Результаты исследования готовы через 4–6 дней после забора материала.

Для анализа используется любой биоматериал, из которого можно получить образец ДНК/РНК. Используют такой метод в онкологии и кардиологии (в том числе для изучения генетической предрасположенности), он точен и чувствителен, однако в России его применяют редко — в этом его главный минус.

Итак, молекулярная диагностика — неинвазивный и точный метод обследования организма с широким спектром применения в разных областях медицины. Если на Западе исследования ДНК/РНК уже распространены повсеместно, то в России подобную услугу предлагают далеко не все клиники.

ДНК диагностика инфекций методом ПЦР

ДНК-диагностика подразумевает выявление и идентификацию генетического материала микроорганизмов в исследуемом материале.

Данный вид диагностики проводится с использованием различных методик исследования.

В практической медицине наибольшее распространение получила ПЦР (полимеразная цепная реакция).

ПЦР позволяет выявить патогенный микроорганизм методом амплификации нуклеиновых кислот.

Принцип методики ПЦР ДНК

Все живые организмы содержат индивидуальную видовую информацию, закодированную определенной, уникальной для каждого вида последовательностью нуклеотидных оснований.

При помощи ПЦР проводится выявление молекул носителя данной информации ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) или РНК (рибонуклеиновая кислота),

Также расшифровывается последовательность нуклеотидных оснований с определением видовой принадлежности.

Данная реакция является ферментативной.

Ее суть заключается в многократном копировании (амплификации) выявленного участка генетического материала.

Благодаря автоматизации процесса, методика получила широкое распространение в практической медицине для диагностики различной инфекционной патологии.

Современный амплификатор для ДНК ПЦР анализов

Какие заболевания диагностируются при помощи ПЦР?

ДНК ПЦР анализы применяются для диагностики большинства инфекций с половым путем передачи.

Это дает возможность достоверной верификации патогенных (болезнетворных) микроорганизмов с последующим установлением диагноза.

И назначением соответствующей этиотропной терапии, направленной на уничтожение возбудителя.

В венерологии, урологии, гинекологии ПЦР применяется для диагностики нескольких групп возбудителей половых инфекций, к которым относятся:

Поговорим о каждой группе.

Поставьте оценку статье: 

ПЦР-диагностика. Что это?

ПЦР-диагностика — это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования,широко применяющийся в диагностике инфекционных заболеваний. ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них — метод ПЦР (полимеразной цепной реакции).На сегодняшний день ПЦР -анализ является одной из наиболее распространенных и динамично развивающихся технологий лабораторной диагностики.На базе клинической лаборатории создана ПЦР- лаборатория. ПЦР (полимеразная цепная реакция) -метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом». Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. Метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллиона других молекул. В настоящее время этот один из наиболее современных и совершенных лабораторных методов диагностики с успехом применяется при исследованиях специалистами клинической лаборатории СПбГУЗ»ГСПК».

ПЦР — (Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) — расшифровывается как полимеразная цепная реакция.

ПЦР диагностика — это метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний, в частности, этот метод широко применяется и для диагностики заболеваний, передающихся половым путем.Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции. «Небольшой фрагмент ДНК» — это несколько сотен пар оснований ДНК , расположенных в строго определенной последовательности.Для ПЦР-диагностики инфекций достаточно небольшого фрагмента, поскольку любая ДНК включает в себя не менее нескольких тысяч оснований.При проведении ПЦР-анализа ведется поиск такого фрагмента ДНК инфекции, который специфичен только для данного микроорганизма. Это значит, что этот фрагмент ДНК «особенный» — он встречается только у этого микроба (или группы родственных микробов), но не встречается ни у одного другого микроба.Сама полимеразная цепная реакция (пцр диагностика) используется для того, чтобы найденный фрагмент размножить, клонировать: чтобы однозначно «увидеть» эти фрагменты ДНК, к окончанию реакции их должно быть не мене 1012 штук.

 История открытия ДНК и разработки метода ПЦР

Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом в 1983г. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет, и за разработку ПЦР-анализа Кэрри Мюллис уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии.Появлению метода проведения полимеразной цепной реакции предшествовали определенные достижения молекулярной генетики: к тому времени уже были расшифрованы нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов и выделены специфические.Также появлению ПЦР много способствовало открытие уникального фермента ДНК-полимеразы (или taq-полимеразы). Именно этот фермент катализирует и «контролирует» все процессы во время проведения анализа методом ПЦР. Особенность этого фермента — он термостабилен, исключительно термостоек: он выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а «любимый» его температурный режим во время работы — 72оС. Многие реакции при проведении ПЦР идут почти исключительно при повышенной температуре.

В настоящее время метод ПЦР-диагностики развивается семимильными шагами. Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются всевозможные модификации ПЦР-анализа. Каждый год на медицинский рынок поступает десятки новых разработок и тест-систем ПЦР-диагностики, предназначенных для выявления нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов — возбудителей инфекционных заболеваний. Новые разработки для проведения ДНК-исследований с каждым разом снижают себестоимость ПЦР-анализа, делая его доступным для широкого использования в диагностических и лечебных целях.

 Ежегодно появляется все больше тест-систем, предназначенных для выявления как возбудителей   различных заболеваний, так и мутаций генов человека.Официальное становление метода ПЦР в России связано с выходом в 1995 г. двух методических рекомендаций: «Диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекций методом цепной полимеразной реакции», в них ПЦР впервые рекомендована к применению в практическом здравоохранении; «Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции». В 1995 г. была впервые подготовлена техническая документация (инструкции, технические условии.) и зарегистрирован в Минздраве России отечественной набор реагентов для ПЦР-диагностики. За прошедшие годы появилось большое количество модификаций ПЦР, позволивших значительно увеличить потенциальные возможности первоначально предложенного метода: мультипраймерная ПЦР, гнездовая ПЦР, ПЦР in situ, ПЦР в режиме реального времени . Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность и специфичность.  

 Изучение ДНК: строение, структура ДНК

 Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — универсальный носитель генетической информации и наследственных признаков у всех существующих на Земле организмов. Открытие ДНК молекулы произошло в 1953 году. Френсис Крик и Джеймс Уотсон открыли структуру двойной спирали ДНК, их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией.ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из из последовательно соединенных нуклеотидов. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться (реплицироваться).В построении новой цепи активным «строителем» выступает специальный фермент — ДНК-полимераза.  Из одной молекулы ДНК образуются две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная. В основе анализа методом ПЦР лежит принцип репликации ДНК — синтеза ДНК, который современным ученым удалось воссоздать искусственно: в лаборатории врачи вызывают удвоение небольшого фрагментаДНК.   Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, другие биологические выделения, биоптаты.Забор материала производится в условиях процедурного кабинета лаборатории соответствующего профиля. После забора пробы вскоре должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию \ Проведению ПЦР предшествует стадия выделения и преципитации ДНК из исследуемого материала. Это обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в ПЦР. \ В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, а точнее — природой его клеточной стенки.  Во многих случаях при ПЦР-диагностике достаточно получить ответ «да» или «нет при первичном выявлении инфекционных возбудителей, судебно-медицинских исследованиях, определении генных мутаций, специфических онкогенов и др.  Методики электрофоретического разделения достаточно стандартизированы и дают вполне воспроизводимые результаты. Результат должен быть безусловно отрицательным в контроле без изучаемой ДНК и положительным — в пробе с ДНК, содержащей искомый участок гена.

 Количественная оценка результатов ПЦР

В ряде клинических ситуаций возникает вопрос о динамике патологического процесса и/или эффективности проводимой терапии. Эти вопросы наиболее актуальны при обследовании пациентов с хроническими инфекциями (гепатиты В ,С, вирус иммунодефицита человека Все большее развитие получает лабораторная диагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) благодаря своей скорости и высокой чувствительности.

Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний:

 Прямое определение наличия возбудителей.

Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

Высокая специфичность.

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

 Высокая чувствительность.

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-анализ обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов — 103-105 клеток).

 .Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

 Высокая скорость получения результата анализа.

Для проведения ПЦР- анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-5 часов 6.Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитарных агентов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды.В настоящее время метод ПЦР-диагностики интенсивно развивается.  Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются всевозможные модификации ПЦР-анализа.Диагностика инфекционных заболеваний является наиболее частым приложением ПЦР в  медицинских учреждениях. Наиболее востребована ПЦР-диагностика вирусов (главным образом, вирусов гепатитов В и С, а также группы герпеса), а также возбудителей скрытых инфекций, передающихся половым путем (хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз и др.).

 ПЦР в диагностике инфекционных болезней

Определить этиологию инфекции (т.е. какой именно микроорганизм или их сочетание вызвали воспалительный процесс). Для некоторых возбудителей, например,Mycoplazma genitalium, ПЦР – это единственный метод диагностики на сегодняшний день.Определить количество возбудителя. Особенно это актуально для условно-патогенных микроорганизмов,которые вызывают патологию только при определенных условиях (например, при повышении концентрации).Осуществить контроль за течением инфекционного процесса и оценить эффективность лечения. Однако необходимо учитывать тот факт, что ПЦР может улавливать даже единичные фрагменты ДНК, которые могут оставаться некоторое время после лечения, в связи с чем, контроль эффективности проводимой терапии рекомендуется проводить не ранее чем через 2-3 недели после ее окончания.Благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном его содержании. Особенно это актуально при бессимптомном течении инфекционного процесса, вызванного безусловно-патогенными микроорганизмами. 

 ПЦР в диагностике гепатитов.

В настоящее время известно как минимум 5 вирусов, способность которых вызывать поражение печени доказана. Это вирусы гепатита А, В, С, D, Е. В редких случаях гепатит может быть вызван вирусом Эпштейна-Барр, вирусом простого герпеса. Способность поражать печень таких агентов как вирус ТТ, вирус гепатита G сегодня признается не всеми. Все вышеперечисленные вирусы относятся к различным семействам, имеют разные биологические свойства и соответственно, тактика лечения будет тоже значительно отличаться в зависимости от этиологии гепатита.

Вирусный гепатит А (ВГА): ПЦР используется для обследования контактных лиц и более раннего выявления заболевших гепатитом  В крови больного гепатитом А вирус присутствует гораздо дольше (иногда до нескольких месяцев), т.е. возможность заражения гепатитом А через кровь не ограничивается вышеуказанными сроками, и ПЦР единственный метод, с помощью которого возможно осуществлять мониторинг вирусемии (наличия вируса в крови)

Вирусный гепатит В (ВГВ): в диагностике вирусного гепатита В ПЦР имеет свои неоценимые достоинства:

Вирусный гепатит С (ВГС). Гепатит С редко протекает с ярко выраженными клиническими симптомами, чаще всего это случайные находки во время лабораторного обследования (обнаружение anti-HCV IgG). Учитывая всю серьезность этого заболевания (частую хронизацию процесса (85%) и возможность развития цирроза печени), становится понятным, насколько важна лабораторная диагностика в решении этого вопроса. И именно ПЦР играет ведущую роль в диагностике гепатита С позволяя:

Установить факт инфицированности гепатитом С. Это важно при обследовании контактных лиц, т.к. РНК ВГС появляется в крови больного гепатитом С гораздо раньше чем антитела, которые появляются как минимум через 2-3 месяца с момента инфицирования (период серологического окна). Во-вторых, определение anti-HCV IgG методом ИФА в некоторых случаях (часто у беременных) дает «ложноположительные» результаты, поэтому обнаружении антител к вирусу гепатита С, рекомендуется подтверждать качественным обнаружением РНК , и в зависимости от результатов ПЦР определяется тактика ведения пациента.Установить наличие показаний к противовирусному лечению, а также выбрать оптимальную схему лечения. Решить эти вопросы помогают количественное определение уровня РНК ВГС(при низкой вирусной нагрузке эффективность лечения выше) и определение генотипа ВГС. Своевременно оценить эффективность проводимого лечения. Так, наиболее эффективными препаратами для лечения хронического гепатита С на сегодняшний день остаются препараты интерферона в комбинации с рибавирином. Курс лечения гепатита С (генотип 1) составляет 48 недель, но уже на 12 неделе лечения врач может оценить эффективность проводимой терапии, сопоставляя результаты анализов до начала лечения и на 12 неделе лечения.Оценить устойчивость ответа на лечение. Для этого проводят обнаружение РНК ВГС после окончания лечения, через 24 недели и через 72 недели после окончания лечения.

Диагностика вирусных гепатитов

 Гепатит А вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита А (HAV)

 В крови для диагностики определяют:

 anti-HAV-IgM — aнтитела к вирусу гепатита А класса IgM – маркер острой инфекции вирусом гепатита А

 anti-HAV-total — aнтитела к вирусу гепатита А суммарные классов IgM и IgG

 Гепатит В вызывается ДНК-содержащим вирусом гепатита В 

В крови для диагностики определяют:HВsAg — поверхностный антиген вируса гепатита В – основной маркер вирусного гепатита В или вирусоносительства;HBeAg — Hbe антиген вируса гепатита В – маркер активной репликации (размножения) вируса в органинизме;Anti-HBs — антитела к HBs антигену вируса гепатита В – маркер защитного иммунитета против вируса гепатита В, определяются также после вакцинации;  Anti-HBc-total — антитела к сердцевинному антигену вируса гепатита В суммарные классов IgM и IgG – маркер перенесенного или текущего гепатита В;Anti-HBc IgM — антитела к сердцевинному антигену вируса гепатита В класса IgM – маркер острого процесса; Anti-HВe — антитела к Hbeантигену вируса гепатита В – маркер перенесенного острого гепатита В, маркер ремиссии; ДНК вируса гепатита В качественное и количественное определение методом ПЦР 

 Гепатит С вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита С (HСV)

В крови для диагностики определяют 

anti-HСV-total — aнтитела к вирусу гепатита С суммарные классов IgM и IgG – маркер инфицирования вирусом гепатита С (перенесенного или текущего)

РНК вируса гепатита С качественное и количественное определение методом ПЦР

Генотипирование вируса гепатита С – для определения тактики и эффективности лечения, прогноза на будущее

 Гепатит D вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита D (HDV)

 Для диагностики применяется качественное определение РНК вируса методом ПЦР в крови.

Гепатит G вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита G (HGV)

Для диагностики применяется качественное определение РНК вируса методом ПЦР в крови.

 Гепатит TT вызывается ДНК-содержащим вирусом гепатита TT (TTvirus)

 Для диагностики применяется качественное определение ДНК вируса методом ПЦР в крови.

 ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции.

В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используется наиболее доступный и одновременно чувствительный подход — обнаружение в крови антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) –anti-HIV  с последующим подтверждением положительных результатов анализа методом иммуноблоттинга (ИБ). Эффективность выявления лиц, инфицированных ВИЧ, с помощью данного подхода может достигать 99% и более, что стало возможным благодаря разработке высокочувствительных и стандартизованных тест-систем для проведения ИФА и ИБ Однако наличие антител к ВИЧ в крови человека является лишь косвенным маркером ВИЧ-инфекции, поэтому неудивительно, что в некоторых случаях современная методология лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции может быть в сущности неинформативной. Так, известно, что в первые недели после заражения антитела к ВИЧ не могут быть выявлены методом ИФА по причине их отсутствия или низкой концентрации (период серологического «окна», который в среднем занимает от 2 до 6 месяцев). Описаны отдельные случаи ВИЧ-инфекции, когда специфические антитела не обнаруживались до 42 мес. с момента инфицирования. Кроме того, у пациентов в терминальном периоде заболевания концентрация антител к ВИЧ может значительно снижаться, что тоже приводит к ложноотрицательным результатам ИФА и ИБ.Практически все тест-системы для ИФА могут давать ложноположительные результаты. Объясняют это явление присутствием в крови антител к антигенам, сходным с антигенами ВИЧ. Данная проблема решается путем дополнительного анализа всех положительных в ИФА сывороток методом ИБ. Однако при исследовании таких образцов, а также сывороток, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов во время сероконверсии (периода ВИЧ-инфекции, когда начинают вырабатываться антитела, но их количество еще не достаточно для выявления), не удается получить однозначные результаты ИБ. Согласно рекомендациям ВОЗ, сыворотки, дающие сомнительные результаты при применении метода ИБ, должны быть повторно исследованы с использованием наборов другой серии или другой фирмы. В случае повторного сомнительного результата рекомендуется наблюдение за пациентом в течение 6 мес. и повторное исследование сывороток через 3 мес. На практике это приводит к значительному удорожанию лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, а также создает известные психологические проблемы для лиц, находящихся под таким наблюдением.Эффективность тестирования на антитела к ВИЧ снижается практически до нуля при обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Показано, что в крови у незараженных детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, антитела к ВИЧ могут обнаруживаться в течение продолжительного времени после рождения (до 1 года и более). С другой стороны, исчезновение антител к ВИЧ может быть вызвано гипоглобулинемией, являющейся следствием вызванного ВИЧ иммунодефицита, и поэтому не может быть основанием для снятия диагноза ВИЧ-инфекции. Поэтому такие дети должны находиться под наблюдением до 36 мес.Перечисленные выше проблемы иммуноферментной диагностики ВИЧ-инфекции могут быть решены с помощью ПЦР.

ПЦР (ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ) КАК МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ В ДНК-ДИАГНОСТИКЕ
Диагностика инфекционных заболеваний

ДНК-диагностика – новая область медицины, использующая молекулярно-генетические методы для ранней диагностики заболеваний, выявления предрасположенности к ним и профилактических рекомендаций.

Развитие таких технологий амплификации ДНК как ПЦР, произвело буквально революцию в клинической вирусологии, позволив быстро, точно и достаточно просто определить наличие вирусов в образце, поскольку известны последовательности ДНК многих болезнетворных микроорганизмов. Можно создать два праймера ПЦР, соответствующих последовательности исследуемого патогена (например, вируса) и расположенных на известном расстоянии на ДНК. Если затем выполнить ПЦР с использованием этих праймеров и с помощью гель-электрофореза провести анализ полученных продуктов, то в случае принадлежности исследуемого образца тому же вирусу, мы получим фрагмент, длина которого соответствует взятой для сравнения последовательности ДНК. Высокая специфичность ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале появляется характерный только для данного вида возбудителя фрагмент ДНК.

Выявляя единичные клетки бактерий или вирусов, ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

В клинической практике метод ПЦР часто используется для выявления вирусных гепатитов, опасных для человека, таких как: А , В , С, «Проведение типирования вируса гепатита С» , Дельта , Е, G , TTV.

Важную роль метод играет в диагностике заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП). Этиологическим фактором являются вирусы, бактерии и простейшие.

К таким заболеваниям можно отнести появление доброкачественных аногенитальных бородовок (кондилом) , вызываемых вирусом папилломы человека (ВПЧ). Такие бородавки обычно появляются на участках, травмированных во время полового контакта. Генотипы ВПЧ 6 и 11 обнаруживаются более чем в 90% случаев. Такие пациенты могут быть одновременно инфицированы и ВПЧ типа 16 и 18, которые являются источником субклинических поражений, сочетающихся с внутриэпителиальной неоплазией и аногенитальным раком. Имеются доказательства, что папилломавирусы, относящиеся к высокоонкогенным (папилломавирусы высокого онкогенного риска — 16,18, 31,33,35, 39,45, 51, 56, 58, 59, 68), являются этиологическим фактором возникновения рака шейки матки.

К заболеваниям передающихся половым путем относятся также и гепатиты В и С. Высокой степени риска инфицирования подвержены гомосексуалисты, лица занятые в сфере оказания сексуальных услуг.

К наиболее распространенным инфекция, передающихся половым путем и диагностируемых методом ПЦР, являются урогенитальные инфекции, вызываемые патогенным микроорганизмом как у мужчин, так и у женщин — Chlamydia trachomatis (хламидия трахоматис). Их диагностика особенно важна для установления диагноза и лечения у лиц с бессимптомным течением. Выявление хламидий трахоматис важно также для установления этиологического фактора, вызвавшего у мужчин орхоэпидидимит (в таких случаях одновременно следует проводить и диагностику методом ПЦР на выявлении гонореи –Neisseria gonorrhoeae). Обнаружение хламидий является важным моментом для диагностики воспалительных заболеваний малого таза у женщин: сальпингита (воспаление маточных труб), эндометрита, параметрита, оофорита (воспаление яичников), тазового перитонита. Другим распространенным инфекционным агентом является бактерия, относящаяся к виду микоплазм — уреаплазма, как правило, передающаяся половым путем (Ureaplasma urealyticum) и ее клинически значимые биовары Parvum/T960, вызывающие воспалительные заболевания органов мочевыделительного тракта и их осложнения: простатит, бактериальный вагиноз, бесплодие.

Применения метода ПЦР оправдано для выявления этиологического фактора уретрита. При гонококковом уретрите методом ПЦР выявляют Neisseria gonorrhoeae. Причиной негонококковых уретритов чаще бывают — Chlamydia trachomatis (в 30-50% случаев), Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma genetalium (возможно 10-20% случаев). К другим факторам негонококковых уретритов можно отнести Trichomonas vaginalis(до 17% случаев) — жгутиковое постейшее, передающееся у взрослых практически только половым путем , а также грибки рода Candida albicans (кандида), вызывающие вульвовагинальный кандидоз.

Хотя бактериальный вагиноз (при синдроме влагалищных выделений) не относится к заболеваниям передающимся половым путем, методом ПЦР диагностики при этом заболевании можно выявить таких микроорганизмов как, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Mobiluncus, избыточная концентрация которых приводит к замещению молочнокислых бактерий влагалища и увеличению рН среды.

К числу распространенных заболеваний, передаваемых половым путем, относятся заболевания вызываемые вирусом герпеса 2 типа (ВПГ-2 — генитальный герпес), который в классических случаях проявляется появлением типичных папулезных высыпаний, переходящих в пузырьки и изъявления, а также местным лимфаденитом. Следует учитывать, что и вирус простого герпеса 1 (ВПГ- 1) также выявляется при поражении гениталий. Герпес ВПГ 1 является причиной, так называемого орально-лабиального герпеса, и вызывает герпес слизистых, кожи, герпетические энцефалиты, офтальмогерпес.

Инфицирование любым из этих двух вирусов приводит к развитию сходного первичного заболевания. Но частота рецидивов заболевания выше при инфицировании герпесом второго типа. Клинические признаки заболевания у пациентов существенно различаются. Инфицирование герпесом может протекать, например, в виде дерматозов или других генитальных инфекций. Поэтому лабораторная диагностика, и в частности ПЦР-метод, является важным приемом в установлении этиологического фактора болезни и назначении соответствующего лечения.

К другим герпес-вирусам, тропным для человека и выявляемым при помощи ПЦР, относится вирус герпеса 3 типа – вызывающий ветряную оспу и опоясывающий лишай. Вирус герпеса 4 типа – вирус Эпштейн-Барр является причиной инфекционного мононуклеоза, а также ассоциируется с лимфомой Беркита и назофарингеальной карциномой. Вирус герпеса 5 типа – вирус цитомегалии (ЦМВ), является причиной поражения печени, центральной нервной системы, возникновением интерстициальной пневмонии и нефритов, опасен для плода в ранние сроки заражения матери при беременности (выкидыши, мертворождения, рождения с пороками органов и систем). Вирус герпеса 6 и 7 типов (лимфотропные вирусы) относятся к вирусам, ассоциированным с синдромом хронической усталости. Вирус герпеса 8 типа – этиологический фактор саркомы Капоши (часто ассоциируемой с ВИЧ инфекцией).

С появлением ПЦР стало возможным количественное определение вирусной нагрузки (уровня виремии), что особенно важно при острых и персистирующих инфекциях, так как просто детекция вируса не дает всей необходимой информации о течении болезни. К тому же определение вирусной нагрузки позволяет следить за лечением и возникновением резистентности к терапевтическим средствам.

Самое широкое распространение методы ПЦР получили в диагностике таких инфекционных заболеваний, как СПИД (вызываемого ретровирусом ВИЧ), клещевой энцефалит, туберкулез, токсоплазмоз, листериоз, краснуха, вирус, вызывающий инфекционную эритему (парвовирус В19),. гемолитический стрептококк, хеликобактер пилори (Helicobacter pylori – этиологический фактор возникновения язвы желудка). ПЦР диагностике подлежат такие вирусы как: аденовирус, риновирус, респираторно-синцитиальный вирус, коронавирус, метапневмовирус, вирус парагриппа, вызывающие поражение дыхательных путей и заболевания протекающие у детей часто в виде энтеритов (клиника дизентерии – боли в животе, поносы). При поражении дыхательных путей (пневмонии) метод ПЦР часто используется для идентификации этиологически значимых микроорганизмов в мазках из зева: Chlamydia pneumonia , Mycoplasma pneumonia , Streptococcus pneumonia (при подозрении на стрептококковую пневмонию). У детей использование ПЦР метода, наряду с бактериологическими и серологическими методами диагностики, позволяет установить или опровергнуть диагноз коклюша и обнаружить токсигенные штаммы дифтерии ( Corynebacterium diphtheriae ).

Очень важно, что часто, нет необходимости дожидаться симптомов болезни. Например, видимые симптомы СПИДа проявляются иногда спустя несколько лет после заражения вирусом. Тем не менее, можно провести анализ ДНК в образцах крови, используя праймеры ПЦР, соответствующие последовательностям, которые присутствуют только в геноме ВИЧ. Особую ценность для диагностики ВИЧ-инфекции ПЦР имеет на двух этапах: в самом начале, когда инфицирование уже произошло, а антитела еще не успели образоваться, и на поздних стадиях заболевания, когда количество антител может снижаться вплоть до полного исчезновения. К тому же количественное определение РНК ВИЧ позволяет оценить варианты противовирусной терапии и осуществить индивидуальный подбор противовирусных препаратов.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам. Примером этому является туберкулез. В отличие от многих бактерий, микобактерия, вызывающая это заболевание, растет очень медленно. Ее культивирование для выполнения классических диагностических испытаний может занять примерно месяц, в то время как идентификация микобактериальной ДНК с помощью ПЦР может быть выполнена в течение одного дня.

Метод ПЦР эффективен как в отношении внутриклеточных паразитов, выявленных как в клиническом материале, полученном от больного, так и в образцах воды, почвы и т.д.

 

Что такое ПЦР?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это эффективный и экономичный способ копирования или «амплификации» небольших сегментов ДНК или РНК.

Используя ПЦР, миллионы копий среза ДНК делаются всего за несколько часов, что дает достаточно ДНК, необходимой для анализа. Этот инновационный, но простой метод позволяет врачам диагностировать и контролировать заболевания с использованием минимального количества образца, такого как кровь или ткань.

Что такое ПЦР?

Подготовка образца Несмотря на то, что ПЦР происходит in vitro или вне лаборатории в лаборатории, она основана на естественном процессе репликации ДНК.В своей простейшей форме реакция происходит, когда образец пробу и ДНК-полимераза, нуклеотиды, праймеры и другие реагенты (искусственные химические соединения) добавляются в пробирку для образцов. Реагенты облегчают реакцию, необходимую для копирования кода ДНК.

Помимо выявления заболеваний в образце, ПЦР позволяет контролировать количество вируса или вирусной нагрузки в организме человека. При таких заболеваниях, как гепатит С или инфекции, вызванные вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусная нагрузка является хорошим показателем того, насколько больным может быть человек или насколько хорошо его лечение и лечение.Вооружившись этой информацией, врачи могут определять, когда начинать лечение, и реакцию человека на лечение, делая лечение индивидуальным для каждого человека.

В каждом цикле ПЦР есть три четких этапа, и каждый цикл приблизительно удваивает количество целевой ДНК. Это экспоненциальная реакция, поэтому в течение 30-40 циклов ПЦР генерируется более одного миллиарда копий исходной или «целевой» ДНК.

Пробоподготовка

Перед началом ПЦР, ДНК должна быть выделена из образца.Выделение ДНК — это многоэтапный процесс, который можно выполнить вручную или с помощью инструмента, такого как инструмент COBAS® AmpliPrep, первого инструмента, который автоматически готовил образцы без вмешательства человека. После подготовки образца запускается трехстадийный процесс ПЦР.

1. Отделение целевой ДНК — денатурация

Во время первого этапа ПЦР, называемого денатурацией, пробирку, содержащую образец ДНК, нагревают до температуры более 90 градусов Цельсия (194 градуса по Фаренгейту), что разделяет двухцепочечную ДНК на две отдельные нити.Высокая температура разрушает относительно слабые связи между нуклеотидами, которые образуют код ДНК.

2. Связывание праймеров с последовательностью ДНК — отжиг

ПЦР

не копирует всю ДНК в образце. Он копирует только очень специфическую последовательность генетического кода, на которую нацелены праймеры для ПЦР. Например, хламидия имеет уникальный паттерн нуклеотидов, специфичных для бактерий. ПЦР будет копировать только определенные последовательности ДНК, которые присутствуют в Chlamydia и отсутствуют у других видов бактерий.Для этого в ПЦР используются праймеры, искусственные олигонуклеотиды (короткие кусочки синтетической ДНК), которые связывают или отжигают только последовательности с обеих сторон области ДНК-мишени. На втором этапе используются два праймера — по одному для каждого из недавно разделенные одиночные цепи ДНК. Праймеры связываются с началом последовательности, которая будет скопирована, отмечая последовательность для третьего шага. На втором этапе трубка охлаждается, и связывание грунтовки происходит при температуре от 40 до 60 градусов Цельсия (104 — 140 градусов по Фаренгейту). На втором этапе получаются две отдельные цепи ДНК с последовательностями, помеченными праймерами.Две нити готовы к копированию.

3. Копирование — расширение

На третьей фазе реакции, называемой расширением, температура увеличивается примерно до 72 градусов Цельсия (161,5 градуса по Фаренгейту). Начиная с областей, отмеченных праймерами, нуклеотиды в растворе добавляются к отожженным праймерам с помощью ДНК-полимеразы, чтобы создать новую цепь ДНК, комплементарную каждой из отдельных цепей матрицы. После завершения расширения были сделаны две идентичные копии оригинальной ДНК.

После создания двух копий ДНК с помощью ПЦР цикл начинается снова, на этот раз с использованием новой дублированной ДНК. Каждый дубликат создает две новые копии, и после примерно 30 или 40 циклов ПЦР было сделано более одного миллиарда копий исходного сегмента ДНК. Поскольку процесс ПЦР автоматизирован, он может быть завершен всего за несколько часов. В медицинских учреждениях ПЦР делает достаточно копий целевой ДНК из клинического образца, чтобы провести анализ; результаты этих диагностических и мониторинговых тестов предоставляют клиницистам и другим медицинским работникам информацию для руководства лечением.

,

Для чего используется ПЦР? — Science Learning Hub

В этом интерактивном приложении рассматривается ряд приложений, в которых используется полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) используется для создания миллионов копий целевого фрагмента ДНК. Это незаменимый инструмент в современной молекулярной биологии, который преобразовал научные исследования и диагностическую медицину.

ПЦР

и его разновидности имеют широкий спектр специализированных применений и используются учеными во всех областях биологии.Результаты также используются учеными во многих других областях.

Читать Что такое ПЦР? для получения дополнительной информации о том, что участвует в процессе ПЦР. Современная биотехнология представляет некоторые способы, которыми ДНК-технологии изменили то, что способны ученые.

В этом интерактиве вы узнаете о разнообразных технологиях, которые возможны благодаря ПЦР.

Благодарности
Научно-образовательный центр признает правообладателей на использование их изображений в нашем интерактиве следующими владельцами:
Изображение медицины, Стивен Максвини, лицензировано 123RF Ltd. Изображение отпечатка пальца
, Arfo, лицензировано 123RF Ltd
Продукты питания и сельское хозяйство Изображение сладкой кукурузы Максим Народенко, лицензировано через 123RF Ltd
Генетическое изображение с двойной спиралью, Педро Ногейра, лицензировано через 123RF Ltd

Стенограмма

Экологическая микробиология

ПЦР способствует нашему пониманию многих экологических проблем, особенно когда обнаружение микроорганизмов в среда требуется.ПЦР позволяет идентифицировать и количественно определить конкретные целевые виды, даже если существует очень небольшое количество. Одним из распространенных примеров является поиск патогенных микроорганизмов или индикаторных видов, таких как кишечная палочка в водоснабжении.

Узнайте, как ПЦР использовались учеными для изучения окружающей среды в разработке анализа, обнаружении вирусов в окружающей среде, жизни в верхней тропосфере и поиске вирусов.

. больше осознавать важность качества воды.Чья ответственность должна быть за мониторингом качества воды? Кому должен быть разрешен доступ к информации о качестве воды? Чья это ответственность за поддержание хорошего качества воды?

Благодарности:
Изображение Plamen Petrov, лицензировано 123RF Ltd.

Потребительская геномика

ПЦР позволила провести персонализированное тестирование генома. Появилась индустрия, предлагающая потребителям индивидуальные продукты и услуги, основанные на информации в их геноме. Например, нутригеномика — это особая форма потребительской геномики, связывающая генетическую информацию с информацией о продуктах, которые могут быть лучше или хуже для конкретных состояний, таких как воспалительные заболевания кишечника.

Пища для размышления:
Как вы можете быть уверены, что продукты действительно полезны? Как вы можете быть уверены в достоверности заявленных продуктов?

Благодарности:
Image © 2006 Ewan Grant-Mackie.

Криминалистика

ПЦР очень важна для идентификации преступников и сбора вещественных доказательств на месте преступления, таких как кровь, волосы, пыльца, сперма и почва. Отпечатки ДНК (также называемые профилями ДНК), идентификация семейных отношений, выделение геномной ДНК и другие молекулярные диагностические и биохимические анализы могут проводиться с помощью ПЦР.ПЦР позволяет идентифицировать ДНК из крошечных образцов — одной молекулы ДНК может быть достаточно для амплификации ПЦР.

Узнайте больше об экстракции ДНК, профилировании ДНК, криминалистике — интересные факты, криминалистика и ДНК или попробуйте детективный ДНК-анализ.

Думать о:
В настоящее время криминалисты могут сравнивать ДНК места преступления только с банком данных образцов ДНК известных преступников.

Что вы думаете об идее создания национальной (и международной) базы данных всех профилей ДНК человека, чтобы помочь в выявлении преступников? Каковы могут быть некоторые последствия для нашего общества, если ДНК каждого человека регистрируется и предоставляется правоохранительным органам? Каковы могут быть некоторые последствия для обеспечения более широкой доступности информации?

Благодарности:
Paul Fleet / 123RF Ltd

Медицина

ПЦР позволила сделать ценные разработки в нескольких медицинских дисциплинах.Например, в настоящее время он используется для диагностики и, следовательно, помощи при лечении многих заболеваний, и он широко используется в исследованиях в области диагностики, лечения и потенциального излечения для целого ряда других. Узнайте больше в статье Использование ПЦР в медицине.

Благодарности:
Изображение предоставлено

.

будущее для диагностики ПЦР

Методика полимеразной цепной реакции (ПЦР), удостоенная Нобелевской премии 1 произвела революцию в молекулярной биологии в своем изобретении в 1986 году и сделала то же самое для медицинской диагностики за последние 15 лет. Возможность копировать и размножать специфические молекулы-мишени ДНК открыла путь к диагностике заболеваний во многих областях быстро, точно и со временем с меньшими затратами.

ПЦР создает неограниченное количество копий ДНК только с одной исходной нити, используя полимеразные ферменты, праймеры (небольшие последовательности ДНК, которые определяют ДНК, подлежащую амплификации) и множество термических циклов.Достижения произошли в 1980-х годах с использованием бактериальных ферментов, способных противостоять высоким температурам, а в 1991 году технология была приобретена фармацевтическим гигантом Roche, который начал совершенствовать науку для использования в медицинской диагностике.

Преимущества ПЦР

‘Современные методы [культивирования] могут быть весьма трудоемкими и иногда могут занимать от нескольких дней до нескольких недель, тогда как количественные методы ПЦР могут дать вам ответы в течение нескольких часов. Это может быть намного быстрее и надежнее », — говорит Ребекка Сандерс, специалист по метрологии нуклеиновых кислот из LGC, Теддингтон, Великобритания.ПЦР-диагностика быстрее и менее подвержена перекрестному загрязнению, потому что методика обычно проводится в автоматических термоциклерах. Он также более чувствителен и более специфичен, чем иммуноанализ на пластинках.

В некоторых случаях ПЦР становится предпочтительным методом диагностики. Например, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) одобрила этот метод для быстрой диагностики туберкулеза легких (ТБ) 2 вместо стандартного метода микроскопии мазка мокроты, разработанного более века назад.ПЦР-тесты или тесты на амплификацию нуклеиновых кислот (NAAT) дают быстрые результаты, и это позволяет использовать их в полевых условиях для ранней диагностики туберкулеза, что важно для предотвращения распространения заболевания.

Потенциал для диагностики ПЦР огромен. «Было бы проще определить, где не будет использоваться ПЦР — все на этой планете имеет геном ДНК или РНК, поэтому, если вы хотите что-то обнаружить, вы переходите на ПЦР», — объясняет Джонатан О’Халлоран, главный научный сотрудник QuantumDx, запуск диагностики ПЦР в Ньюкасле, Великобритания.Он добавляет, что наряду с клиническим применением диагностика ПЦР также может стать важной в таких отраслях, как производство продуктов питания и сельское хозяйство. Еще одним преимуществом диагностики ПЦР является их использование в мультиплексных анализах — амплификация нескольких мишеней в одном эксперименте ПЦР путем простого использования нескольких пар праймеров. Это может быть полезно при диагностике инфекционных агентов, когда симптомы не так легко охарактеризовать. В одном тесте может быть охвачено до 20 патогенов. 3


Арон Коэн, главный исполнительный директор лондонской диагностики.ai, говорит, что в настоящее время в экосистеме диагностики ПЦР в настоящее время преобладают лабораторные тесты, «на данный момент очень мало тестов, которые одобрены FDA, возможно, 10 различных анализов имеют одобрение FDA (например, на ВИЧ) и имеют полную автоматизацию, но в подавляющем большинстве люди полагаются на лабораторно разработанные тесты. ‘

КПЦР прокладывает путь

Большинство диагностических методов будет основываться на ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР (КПЦР). 4 Работает с использованием флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов и контроля флуоресценции после каждого цикла — интенсивность сигнала отражает количество амплифицированной ДНК, а количество циклов, при которых флуоресценция впервые обнаружена, используется для расчета исходного числа молекул ДНК в образце, как только система была откалибрована.

Признавая важность молекулярной диагностики для ранней диагностики опасных для жизни инфекций, Bruker недавно запустила ПЦР в режиме реального времени для лечения инвазивных грибковых заболеваний. Fungiplex® Aspergillus и Fungiplex® Candida обнаруживают ДНК Aspergillus и Candida соответственно, непосредственно из образцов пациентов, позволяя раннюю диагностику инвазивного заболевания, не дожидаясь появления грибкового патогена в культуре. Целевая противогрибковая медикаментозная терапия может быть назначена ранее для улучшения результатов лечения пациентов.

КПЦР также был адаптирован для обнаружения РНК-вирусов, таких как ВИЧ и гепатит С, и анализа транскриптов РНК, связанных с некоторыми видами рака. В двухэтапной обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) молекулы РНК превращаются в свои последовательности комплементарной ДНК (кДНК) ферментами обратной транскриптазы с последующей амплификацией кДНК с помощью стандартной ПЦР. Новый сверхбыстрый метод в разработке может обещать более эффективный процесс, особенно при анализе большого количества образцов.Метод использует генно-инженерную термостабильную обратную транскриптазу, поэтому процесс ПЦР может происходить непосредственно из РНК. 5

Преодоление ограничений

Но есть и ограничения, связанные с диагностикой ПЦР, «все дело в пробоподготовке с помощью ПЦР, в отличие от иммунодиагностики, где вы можете по существу использовать необработанный образец сыворотки крови, диагностика ПЦР требует от вас сделать сложную пробоподготовку, — говорит О’Халлоран. Многие органические и неорганические вещества будут ингибировать ПЦР, поэтому их необходимо удалить, и эти дополнительные стадии усложняют процедуру.

Ряд компаний и академических групп ищут технологии для улучшения диагностики ПЦР. Альтернативный метод температурного цикла разрабатывает Люк Ли, профессор биоинженерии в Калифорнийском университете в Беркли. Он разработал способ ускорения циклического изменения температуры — с помощью плазмоники — взаимодействия света с металлическими поверхностными электронами, которые генерируют тепло. Светодиоды нагревают 120-нм золотую пленку в контакте с раствором ДНК в микрофлюидальной лунке. Механизм позволял ездить на велосипеде от 55 до 95 ° С 30 раз за 5 минут.

O’Halloran QuantumDx выпустил портативное настольное устройство, которое может сократить время теста до 7 минут и улучшило чувствительность до 1 клетки на мл — огромное улучшение по сравнению со стандартными методами, которые составляют около 150 клеток на мл. Это было достигнуто с использованием умной микрофлюидики и технологии полевого транзистора с нанопроволоками. 7 «Мы решаем некоторые проблемы чувствительности, используя действительно новую физику, называемую диэлектрофорезом», — объясняет О’Халлоран.Это явление вызывает воздействие силы на частицу в неоднородном электрическом поле и позволяет захватывать точные представляющие интерес ячейки из необработанного образца: «Мы устанавливаем электрические поля с частотой и величиной, которые вызывают дипольные моменты именно в представляющую интерес клетку, и мы используем микрожидкости для высвобождения этих концентрированных клеток в нашу ПЦР. ‘

В больших диагностических лабораториях большая часть ПЦР проводится автоматизированными роботизированными высокопроизводительными системами. Но стандартизация и контроль качества для ПЦР все еще требуют кропотливого участия человека.Инновационный стартап-диагностика .ai предлагает решение с использованием искусственного интеллекта. «Мы эффективно наполняем учебную машину контролируемым набором данных, набором входных данных с кучей известных результатов, и обучающая машина автоматически проверяет себя и гарантирует, что она может давать те же результаты на регулярной основе — чего нельзя сделать без ручного ввода в Современные системы из-за изменчивости ПЦР в реальном времени на разных платформах и в разных анализах », — говорит Коэн. Как только их система была настроена, о результатах можно сообщить почти сразу, и это будет только отмечать неожиданные результаты, которые требуют дальнейшего анализа.Испытание системы проводится крупнейшим в Великобритании поставщиком патологических услуг Viapath в одной из их ведущих лабораторий.

Цифровая точность

Изобретенная в начале 1990-х годов, но замененная КПЦР в 1996 году, цифровая ПЦР вернулась для специализированных применений. Методика не требует стандартной калибровки, но работает путем разделения исходного образца на большое количество отдельных лунок перед амплификацией, так что в каждой лунке будет 1 или 0 молекул ДНК (отсюда и цифровая).После амплификации простой расчет положительных или отрицательных лунок может определить абсолютную количественную оценку. 8

«Цифровая технология обеспечивает такой уровень точности, которого вы просто не можете достичь с помощью КПЦР», — говорит Сандерс, но, как отмечает О’Халлоран, — «это откровенно излишне для большинства клинических применений». Это полезно, когда вам нужно точно знать, сколько цели находится в вашем образце. «Например, существуют некоторые виды рака, вызванные несколькими копиями одного и того же гена, поэтому изменение количества копий и знание количества копий может изменить режим лечения», — объясняет Сандерс.Она говорит, что в настоящее время большинство больниц не имеют доступа к такого рода приборам; «стоимость должна снизиться, и это произойдет, если на рынке появится больше платформ».

Взгляд в будущее

ПЦР-диагностика также окажет большое влияние на будущий рост точной медицины — индивидуализация медицинской помощи для конкретного пациента. О’Халлоран говорит, что QuantumDx уже разработал тест варфарина. Антикоагулянтный препарат, который выбирался десятилетиями, недавно был заменен на дорогостоящие альтернативы из-за риска тромбоза и других осложнений в подгруппе пациентов.«Увеличение расходов [антикоагулянтов] составляет сотни тысяч фунтов в год, — говорит О’Халлоран, — но мы разработали тест, который позволяет нам провести быстрый тест на пациентах, а затем сказать врачу, который может принимайте варфарин (который составляет 75% нашего населения) ».

В конечном счете, О’Халлоран рассматривает диагностику ПЦР как нечто, что расширится до первичной медицинской помощи:« вы увидите ее в кабинете врача и в аптеке, она собирается действительно захватывающее время для ПЦР ». QuantumDx работает над ручным устройством ПЦР, и он предлагает однажды, что оно может сидеть в нашей домашней аптечке рядом с термометром:« Я не вижу причин, почему это не может произойдет в течение следующих 10 лет.’

Список литературы

1 Mullis KB и Faloona FA« Специфический синтез ДНК in vitro с помощью полимеразно-катализируемой цепной реакции ». Методы в энзимологии том. 155 (F) pp. 335–50 (1987)

2 Boehme et al. 2010. Быстрое молекулярное выявление туберкулеза и устойчивости к рифампину. N Engl J Med. 363: 1005-1015, DOI: 10.1056 / NEJMoa0907847

3 Paul C. Schreckenbergera и Alexander J. McAdamb. Точка-контрапункт: большие мультиплексные ПЦР-панели должны быть тестами первой линии для выявления респираторных и кишечных патогенов.J. Clin. Microbiol. Октябрь 2015 г. 53 нет. 10 3110-3115. doi: 10.1128 / JCM.00382-15

4 Петр Кралик и Маттео Риччи. Основное руководство по ПЦР в реальном времени в микробной диагностике: определения, параметры и все. Фронт Микробиол. 2017; 8: 108. doi: 10.3389 / fmicb.2017.00108

5 Петра Чованкова, Верена Мерк, Андреас Маркс, Марсель Лейст, Рамон Кранастер; Количественная ПЦР с обратной транскрипцией непосредственно из клеток без выделения РНК и без изотермической обратной транскрипции: протокол RT-qPCR «с нулевой стадией», «Биологические методы и протоколы», том 2, выпуск 1, 1 января 2017 года, bpx008, https: // DOI.org / 10.1093 / biomethods / bpx008

6 Джун Хо Сон, Бьюнгра Чо, Сун Гвон Хон, Сан Хун Ли, Ори Ходжа, Аманда Дж. Хаак и Люк П. Ли. Сверхбыстрая фотонная ПЦР. Light: Science & Applications том 4, страница e280 (2015) doi: 10.1038 / lsa.2015.53

7 http://quantumdx.com/systems/q-poc

8 Джим Ф. Хуггетт, Александра Кит , Цифровая ПЦР как новая технология и ее потенциальные последствия для молекулярной диагностики. Клиническая химия.2013, 59 (12) 1691-1693; DOI: 10.1373 / clinchem.2013.214742

,

История тестирования ДНК | Центр диагностики ДНК

Новое тестирование ДНК по делу об убийстве Хьюстона в 2010 году привело к реабилитации одного человека — после девяти лет за решеткой — и аресту другого.

Лиделл Грант, 43 года, был признан виновным в том, что зарезал 28-летнего Аарона Ширхорна до смерти в окрестностях ночного клуба по показаниям под присягой нескольких свидетелей, согласно сообщениям. Он был очищен в прошлом месяце — и освобожден из тюрьмы — после того, как ДНК, полученная из отпечатков пальцев Ширхорна, была проверена с использованием новой технологии.Он отбывал пожизненное заключение.

В четверг 41-летнему Джермарико Картеру было предъявлено обвинение в убийстве после того, как та же ДНК связала его с преступлением. Следователи получили совпадение с его ДНК, используя базу данных ФБР, содержащую ДНК осужденных преступников, сообщил в воскресенье Fox 26 Хьюстон.

«От имени полицейского управления Хьюстона я хочу принести извинения мистеру Гранту и его семье, которые все эти годы ждали справедливости», — заявил в пятницу начальник полиции Хьюстона Арт Асеведо в Twitter.Асеведо сказал, что Картер «недавно признался в своей роли в убийстве мистера Ширхорна». По словам шефа, Картер находился под стражей в Грузии по несвязанным обвинениям.

Грант сказал в субботу, что он не злился на Гранта за то, что он сидел в тюрьме за преступление, которое он совершил, сообщает Fox 26. «Я совсем не злюсь на него», — сказал он, сообщает станция. «Я прощаю его, потому что он теперь знает, что он сделал».

Станция сообщила, что по состоянию на субботу Грант больше не должен был носить монитор лодыжки или соблюдать комендантский час.Прокуроры Хьюстона заявили, что будут ходатайствовать об официальном оправдании Гранта в Апелляционном суде по уголовным делам штата Техас. Ассошиэйтед Пресс цитирует адвоката Гранта Майка Вэра из «Техаса невиновности», который говорит, что он считает, что ошибочные показания свидетелей, основанные на устаревших и проверенных методах, используемых детективами, помогли ошибочно осудить его клиента.

Ошибочные свидетельские показания привели к более чем 70 процентам из более чем 360 неправомерных приговоров в США.которые были опровергнуты доказательствами ДНК после осуждения, согласно Проекту Невинности.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *