Conium гомеопатия: Кониум-Плюс инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Konium-Plus Гранулы гомеопатические (35305)

Содержание

Conium maculatum — Гомеопатическая Аптека

Описание

Пятнистый болиголов

Старое средство, ставшее классическим после знаменитого описания Платоном картины смерти Сократа. Вызывает восходящий паралич, заканчивающийся смертью от остановки движений грудной клетки и диафрагмы, — это, так сказать, «заключительный этап» действия этого средства: к нему «стремятся все симптомы» при испытаниях этого препарата.

Conium является прекрасным средством при таких состояниях, как нарушения походки, дрожь, внезапная потеря сил во время ходьбы, болезненная тугоподвижность ног и т. п. Такие состояния часто можно встретить у стариков — периоды слабости, вялости, местные конгестии и медлительность. Эти и другие специфические симптомы являются показаниями к назначению Conium. Они соответствуют состояниям слабости, ипохондрии; мочевым расстройствам; ослаблению памяти; половой слабости. Расстройства, вызванные переменой образа жизни у холостяков и старых дев. Рост опухолей также служит показанием к назначению этого средства. Общее состояние больного такое, точно его сильно избили. Значительная слабость утром в постели. Слабость физическая и умственная, дрожь, учащенное сердцебиение. Раковый диатез. Артериосклероз. Кариес грудины. Увеличение лимфатических узлов: действует на железы тела, вызывая их переполнение, набухание, а затем — индурацию и изменение их структуры, как это бывает при золотушных и раковых состояниях. Тонизирующее после гриппа. Бессонница при полиневрите.

Психика. Возбуждение, которое в конце-концов приводит к умственной и душевной депрессии. Подавлен, робок, избегает общества, но боится оставаться в одиночестве. Не испытывает желания работать или учиться, не может ничего делать. Память слабая: не может ничего говорить.

Голова. Головокружения при укладывании в постель, когда переворачивается в постели, когда поворачивает головув сторону или скашивает глаза, особенно слева; ухудшение при сотрясениях головы, при малейшем шуме или при разговоре других. Головные боли до помрачения сознания с тошнотой и рвотой слизью с ощущением, будто под черепом находится какое-то инородное тело.

Ощущение жара на макушке. Ощущение тугого сжатия головы в области висков; ухудшение после еды (Gels.; Atropine.). Односторонние боли, как от ушибов. Тупые затылочные боли при утреннем вставании.

Глаза. Светобоязнь и сильное слезотечение. Пустулы на роговице. Затуманивание зрения; хуже при искусственном свете. Потеет при закрывании глаз. Паралич глазодвигательных мышц (Caust.). Поверхностные воспаления роговицы типа фликтенозного конъюнктивита и кератита. Малейшее изъязвление или ссадина на роговице вызывают сильную светобоязнь.

Уши. Ослабление слуха; кровянисто окрашенные выделения из уха.

Нос. Легко кровоточит и легко становится болезненным. Полипы.

Желудок. Болезненность в области корня языка. Ужасная тошнота, кислая изжога и кислая отрыжка; ухудшение при укладывании в постель. Болезненные спазмы желудка. Улучшение от еды и затем ухудшение через несколько часов после еды; кислотность и жжение; болезненная точка на уровне грудины.

Живот. Жестокие боли в самой печени и вокруг. Хроническая желтуха и боли в правом подреберье. Болезненная чувствительность, ощущение ушибленности, опухания, «кинжальные» боли. Болезненное уплотнение.

Стул. Частые и настойчивые позывы; твердый с тенезмами. Слабость с дрожью после каждой дефекации (Verat.; Ars.; Arg. n.). Жар и жжение в прямой кишке во время дефекации.

Мочевыделительная система. Очень затрудненное мочеиспускание.Струя прерывается (Ledum.). Мочеиспускание прерывистое (Clematis.). Выделение мочи по капле у стариков (Copaiva.).

Мужские половые органы. Повышение желания, но потенция снижена. Половая неврастения со слабостью эрекций.Эффекты подавления полового влечения. Яички твердые и увеличенные.

Женские половые органы. Дисменорея с тянущим вниз ощущением вдоль бедер. Молочные железы отвислые и сморщенные, твердые, болезненные при прикосновении. Колющие боли в сосках. Желание покрепче сдавливать груди руками. Менструации запаздывающие и скудные; чувствительность наружных половых органов. Молочные железы увеличиваются и становятся болезненными перед менструацией и во время нее (C alc. c.; Lac can.). Высыпания перед менструацией. Зуд в области наружных половых органов. Неготовность к зачатию. Индурация маточного зева и шейки. Овариит; увеличение яичников с затвердением; стреляющие боли. Болезненное состояние после подавления полового влечения или при прерывании менструации, а также от половых излишеств. Лейкорея после мочеиспускания.

Респираторные органы. Сухой кашель — почти постоянное покашливание; ухудшение вечером и ночью; вызывается наличием в гортани сухих точек с зудом в грудной клетке и глотке, при укладывании, при разговоре или смехе и во время беременности. Отхаркивание только после длительного кашля. Задыхается при малейшем усилии; угнетение дыхания и сжатие в грудной клетки; боли в груди.

Спина. Боли в спине между плечами. Последствия ушибов спины и позвоночника. Кокцигодиния. Тупые боли в поясничной и крестцовой области.
Конечности. Тяжелые, слабые, парализованные; дрожащие; онемение пальцев кистей и стоп. Мышечная слабость, особенно, нижних конечностей. Кисти рук сильно потеют. Боли облегчаются, когда стопы кладут на возвышение — на стул и т. п.

Конечности. Тяжелые, слабые, парализованные, дрожащие, онемение пальцев кистей и стоп. Мышечная слабость, особенно нижних конечностей.Кисти рук сильно потеют. Боли облегчаются, когда стопы кладут на возвышение – на стул и т.п.

Кожа. Болезненность подмышечных узлов с чувством онемения вдоль руки. Затвердение после ушиба. Желтая окраска кожи с папулярным высыпанием: желтые ногти. Лимфатические узлы (кожные и мезентериальные) увеличенные и затвердевшие. Колющие боли, пронизывающие железы насквозь. Опухоли с пронизывающими болями; ухудшение по ночам. Хронические язвы со зловонными выделениями. Сильно потеет во сне или даже лишь закрыв глаза. Ночные и утренние поты с дурным запахом и жжением кожи.

МОДАЛЬНОСТИ. Ухудшение при укладывании в горизонтальное положение; при поворачивании в постели или при вставании с нее; под влиянием полового воздержания; перед менструацией и во время нее; от простуды; от физического или умственного усилия.

Улучшение при воздержании от приема пищи; в темноте; когда можно свешивать вниз свои конечности; от движения и от давления.

ВЗАИМОСВЯЗИ. Подобные: Baryt.; Hydrast.; Iod.; Kali phos.; Hyos.; Curare.

Сравните: Scirrhinum (нозод рака). Раковый диатез; увеличение желез; рак молочной железы; глисты.

РАЗВЕДЕНИЯ. Лучше в высоких разведениях, которые дают не часто — особенно, в случаях новообразований, парезов и т. п. А в остальных случаях — от шестого до тридцатого.

 

Кониум — средство для «элегантного возраста»

Больной К. 56 лет, обратился в августе 1999 года с жалобами на затруднение при мочеиспускании, периодически ноющие боли в правом подреберье. На УЗИ определили аденому предстательной железы 3 степени и предложили оперативное лечение. Но мужчина не пожелал делать операцию и пришёл на гомеопатический приём.

При осмотре: мужчина умеренного питания, но с большим животом, на шее «вдовий холмик», на коже груди, на плечах – множественные гемангиомы, пигментные пятна различной величины, ксантомы. Кроме того, отмечался небольшой экзофтальм, гиперплазия щитовидной железы.

Гормоны щитовидной железы – на верхней границе нормы. Учитывая данные осмотра и особенности кожных покровов, признаки нарушения гормонального фона и обмена веществ, назначен Кониум 200 СН — 3 раза в неделю.

Пациент лечился в течение года, приходил на приём с периодичностью 1 раз в два месяца. В последнее посещение – жалоб не предъявляет, «чувствует себя как молодой».

Через год — повторное УЗИ предстательной железы – аденома не определяется. Доктор, который делал УЗИ, воскликнул: « Не может быть!»

Но кроме чудесного избавления от аденомы у мужчины очистилась кожа, уменьшилось количество пигментных и холестериновых пятен, кроме того, исчезла аллергия на спиртные напитки, которые не давали нормально отмечать праздники последние 3 года из-за болей в правом подреберье и ввиду появления красных зудящих пятен на коже.

Кониум готовится из очень ядовитого растения Болиголов.Это растение было известно ещё в древней Греции, его использовали как специальный яд для исполнения смертного приговора.

Великий философ Сократ был казнён именно с помощью напитка из кониума (цикуты). Сократ умер медленно от последовательно возникающего паралича нервных волокон. Сначала парализовало конечности, так что он не мог ходить, затем руки, затем трудно стало дышать, т.е. возник паралич дыхательных мышц, а затем паралич сердечной деятельности – и Сократ умер. Но не всё так трагично, когда мы имеем дело с гомеопатией. «Яд может быть великолепным лекарством, всё зависит от дозы!», как учат нас Гиппократ и Парацельс.

Кониум в гомеопатических дозах применяется для лечения головокружений, недостаточности кровообращения в ВББ, в лечении новообразований, доброкачественных опухолей, в т. ч. мастопатии, фибромиом, узлов щитовидной железы, аденом предстательной железы, но эффект будет только в том случае, если лекарство соответствует человеку по конституции.

Среди пациентов, чувствительных к Кониуму большое количество пожилых людей и даже лиц среднего возраста, то есть людей находящихся в состоянии возрастной гормональной перестройки или на пороге её.

Поэтому Кониум довольно востребованное лекарство и всегда оправдывает ожидания.

← назад

Conium (Кониум) Mix_MM | Архив Школы Гомеопатов

Описание гомеопатического препарата Conium (Кониум макулатум)

Витулькас

Conium maculatum – Болиголов крапчатый (пятнистый)

Слабость, прогрессирующая в паралич
Железы, твердые как камень. Опухоли.
В сознании, мозгу ощущение, что тоже есть «участки уплотнения»: застревает на чем-то и не может сдвинуться. В Греции есть выражение: «мозоль(камни) в голове». Идея, с которой человек не расстается, прогрессирует в навязчивую идею. Идеи – фикс могут доходить до невроза навязчивых состояний.
Суеверны: «если я снимаю брюки, но в этот момент на улице проходит машина – значит, надо одеть брюки обратно». «Я не могу пойти туда, так как то-то, сюда, так как то-то».

В эмоциональной сере также «паралич, уплотнения»: есть сферы, которые вообще не сдвигаются. Есть эмоции которые застывают, и он их не выражает. Они неэмоциональные, необщительные.

Вызывает слабость, тремор, дрожание, паралич на эмоциональном и физическом (если подавлять гормональную активность) уровне.
Это очень материалистичный человек, который постоянно должен давать выход своим половым гормонам. Если гормоны не выпускаются, и гормональная сфера заблокирована, начинаются проблемы. Они очень сексуальны, им нужен регулярный секс, в молодости 2-3 раза в день.

Если женщина теряет мужа в 55-60 лет, но она привыкла с ним к определенному ритму сексуальной жизни, то при потере секса у нее вначале появится некая вялость, сонливость, неясность в голове, постепенно прогрессирующая в головокружение (при повороте в постели, вставании и т.п. головокружения ухудшаются, небольшое движение – и «вся комната ходит ходуном»). При этом она не может завязать новые отношения, так как, являясь необщительным человеком, привыкает к единственному сексуальному партнеру. Эти женщины страдают от опухолей, особенно в половых органах.

При подавлении сексуального влечения развиваются: уплотнения, опухоли в железах половой системы, чаще в молочных железах у женщин, в простате (опухшая твердая простата) у мужчин, которые могут озлокачествляться + в голове неясность.

Жалобы: на опухшие твердые болезненные половые железы + «у меня голова никогда не бывает ясной»
Conium чаще всего не дает выход свои нормальным сексуальным потребностям. Они как бы отрицают необходимость сексуальной разрядки, вытеснив её из сознания по каким либо причинам. Например, жена отказывает мужу в сексе, от этого его простата прогрессивно увеличивается в размере, болит, твердеет, а голова все менее и менее ясная.

Паралич восходящий, при этом голова никогда не бывает ясной.

Тремор, в 1ю очередь нижних конечностей, иногда еще и верхних.

Но Conium не показан при болезни Паркинсона, так как у него не интенсивный тремор, а адинамический тремор – от слабости – ноги подкашиваются от слабости и дрожат (тонкая, мелкая дрожь)

Мочеиспускание начинается и прерывается, начинается и прерывается, т.е. требуется 3-4 этапа, чтобы помочиться. Так же с менструациями (в климаксе??).

При бронхите он ложится и кашляет-кашляет до тех пор, пока не встанет или сядет или пока не выйдет хоть капля слизистой мокроты.

Вопрос: если подросток нуждается в мастурбации, но подавляет себя, контролирует. Является ли это подавлением, которое вызывает симптомы – Conium ли это? И что лучше контролировать себя или дать себе выход?

Витулкас: если вы можете себя контролировать, лучше контролировать.

Но, если от этого возникают симптомы типа Conium, дайте Conium – и вы поможете пациенту. Но это редкость, т.к. молодые редко имеют какие-то побочные эффекты от подавления сексуального влечения. Идеально для молодого человека себя сдерживать, пока он не найдет себе жену.

Сильно потеет во сне.
Хуже: когда смотрит на движущиеся предметы, от алкоголя, после физического усилия, старость, ночью, от хлеба, закрывая глаза, от воздержания

Лучше: Свесив больную конечность, От движения, В темноте, От давления, Ходит согнувшись
Хочет: соль, кислое, кофе

Conium maculatum
Болиголов крапчатый (пятнистый)

Ментальный:
СУЕВЕРНЫЙ. Навязчивые идеи.
Материалист, практический, деловой тип.
Нет желания заниматься бизнесом или учебой, ни к чему нет никакого интереса.
Слабая память. Эмоции парализованы.
Возбуждение вызывает депрессию. Грустный и мрачный.
Боится остаться один, но все же избегает общества.

Физический:
Поражает НЕРВЫ и МЫШЦЫ. ДРОЖАНИЕ конечностей.
ПОСТЕПЕННО НАСТУПАЮЩИЙ ПАРАЛИЧ и УПЛОТНЕНИЕ (ИНДУРАЦИЯ) тканей.
Воздействует на ГРУДНЫЕ ЖЕЛЕЗЫ и вызывает в них ОБРАЗОВАНИЯ ТВЕРДЫЕ как КАМЕНЬ (уплотнения).
Сильная болезненность грудей.
Применяется для УСТРАНЕНИЯ ПАГУБНЫХ ПОСЛЕДСТВИЙ ПОДАВЛЕНИЯ СЕКСУАЛЬНОГО ЖЕЛАНИЯ или избыточного потворства этому желанию.
ПРОСТАТИТ или заболевания МАТКИ – ВЫДЕЛЕНИЯ ПРЕРЫВАЮТСЯ, затем появляется снова.
Сухой и отрывистый непрерывный КАШЕЛЬ, хуже (<) лежа, должен сесть. Обильный пот во время сна. Модальности: УХУДШЕНИЕ; когда смотрит на двигающие объекты; от алкоголя; после напряжения; в преклонном возрасте, ночью и от полового воздержания; хлеба; когда закрывает глаза. УЛУЧШЕНИЕ: когда пораженная часть свисает вниз. От движения, темноты, давления. Когда идет, согнувшись. ЖЕЛАНИЕ: соли, кислого, кофе.

Берике

Conium является прекрасным средством при таких состояниях, как нарушения походки, дрожь, внезапная потеря сил во время ходьбы, болезненная тугоподвижность ног и т. п. Такие состояния часто можно встретить у стариков – периоды слабости, вялости, местные конгестии и медлительность. Эти и другие специфические симптомы являются показаниями к назначению Conium. Они соответствуют состояниям слабости, ипохондрии; мочевым расстройствам; ослаблению памяти; половой слабости.

Расстройства, вызванные переменой образа жизни у холостяков и старых дев. Рост опухолей также служит показанием к назначению этого средства. Общее состояние больного такое, точно его сильно избили. Значительная слабость утром в постели. Слабость физическая и умственная, дрожь, учащенное сердцебиение.

Раковый диатез. Артериосклероз. Кариес грудины.Увеличение лимфатических узлов: действует на железы тела, вызывая их переполнение, набухание, а затем – индурацию и изменение их структуры, как это бывает при золотушных и раковых состояниях. Тонизирующее после гриппа. Бессонница при полиневрите.

Психика. Возбуждение, которое в конце-концов приводит к умственной и душевной депрессии. Подавлен, робок, избегает общества, но боится оставаться в одиночестве. Не испытывает желания работать или учиться, не может ничего делать. Память слабая: не может ничего говорить.

Голова. Головокружения при укладывании в постель, когда переворачивается в постели, когда поворачивает голову в сторону или скашивает глаза, особенно слева; ухудшение при сотрясениях головы, при малейшем шуме или при разговоре других. Головные боли до помрачения сознания с тошнотой и рвотой слизью с ощущением, будто под черепом находится какое-то инородное тело. Ощущение жара на макушке. Ощущение тугого сжатия головы в области висков; ухудшение после еды (Gels.; Atropine.). Односторонние боли, как от ушибов. Тупые затылочные боли при утреннем вставании.

Глаза. Светобоязнь и сильное слезотечение. Пустулы на роговице. Затуманивание зрения; хуже при искусственном свете. Потеет при закрывании глаз. Паралич глазодвигательных мышц (Caust.). Поверхностные воспаления роговицы типа фликтенозного конъюнктивита и кератита. Малейшее изъязвление или ссадина на роговице вызывают сильную светобоязнь.

Уши. Ослабление слуха; кровянисто окрашенные выделения из уха.

Нос. Легко кровоточит и легко становится болезненным. Полипы.

Желудок. Болезненность в области корня языка. Ужасная тошнота, кислая изжога и кислая отрыжка; ухудшение при укладывании в постель. Болезненные спазмы желудка. Улучшение от еды и затем ухудшение через несколько часов после еды; кислотность и жжение; болезненная точка на уровне грудины.

Живот. Жестокие боли в самой печени и вокруг. Хроническая желтуха и боли в правом подреберье. Болезненная чувствительность, ощущение ушибленности, опухания, “кинжальные” боли. Болезненное уплотнение. Стул. Частые и настойчивые позывы; твердый с тенезмами. Слабость с дрожью после каждой дефекации (Verat.; Ars.; Arg. n.). Жар и жжение в прямой кишке во время дефекации. Мочевыделительная система. Очень затрудненное мочеиспускание. Струя прерывается (Ledum.). Мочеиспускание прерывистое (Clematis.). Выделение мочи по капле у стариков (Copaiva.).

Мужские половые органы. Повышение желания, но потенция снижена. Половая неврастения со слабостью эрекций. Эффекты подавления полового влечения. Яички твердые и увеличенные.

Женские половые органы. Дисменорея с тянущим вниз ощущением вдоль бедер. Молочные железы отвислые и сморщенные, твердые, болезненные при прикосновении. Колющие боли в сосках. Желание покрепче сдавливать груди руками. Менструации запаздывающие и скудные; чувствительность наружных половых органов. Молочные железы увеличиваются и становятся болезненными перед менструацией и во время нее (Calc. c.; Lac can.). Высыпания перед менструацией. Зуд в области наружных половых органов. Неготовность к зачатию. Индурация маточного зева и шейки. Овариит; увеличение яичников с затвердением; стреляющие боли. Болезненное состояние после подавления полового влечения или при прерывании менструации, а также от половых излишеств. Лейкорея после мочеиспускания.

Респираторные органы. Сухой кашель – почти постоянное покашливание; ухудшение вечером и ночью; вызывается наличием в гортани сухих точек с зудом в грудной клетке и глотке, при укладывании, при разговоре или смехе и во время беременности. Отхаркивание только после длительного кашля. Задыхается при малейшем усилии; угнетение дыхания и сжатие в грудной клетки; боли в груди. Спина. Боли в спине между плечами. Последствия ушибов спины и позвоночника. Кокцигодиния. Тупые боли в поясничной и крестцовой области.

Конечности. Тяжелые, слабые, парализованные; дрожащие; онемение пальцев кистей и стоп. Мышечная слабость, особенно, нижних конечностей. Кисти рук сильно потеют. Боли облегчаются, когда стопы кладут на возвышение – на стул и т. п.

Кожа. Болезненность подмышечных узлов с чувством онемения вдоль руки. Затвердение после ушиба. Желтая окраска кожи с папулярным высыпанием: желтые ногти. Лимфатические узлы (кожные и мезентериальные) увеличенные и затвердевшие. Колющие боли, пронизывающие железы насквозь. Опухоли с пронизывающими болями; ухудшение по ночам. Хронические язвы со зловонными выделениями. Сильно потеет во сне или даже лишь закрыв глаза. Ночные и утренние поты с дурным запахом и жжением кожи.

МОДАЛЬНОСТИ. Ухудшение при укладывании в горизонтальное положение; при поворачивании в постели или при вставании с нее; под влиянием полового воздержания; перед менструацией и во время нее; от простуды; от физического или умственного усилия. Улучшение при воздержании от приема пищи; в темноте; когда можно свешивать вниз свои конечности; от движения и от давления.

ВЗАИМОСВЯЗИ. Подобные: Baryt.; Hydrast.; Iod.; Kali phos.; Hyos.; Curare. Сравните: Scirrhinum (нозод рака). Раковый диатез; увеличение желез; рак молочной железы; глисты.

РАЗВЕДЕНИЯ. Лучше в высоких разведениях, которые дают не часто – особенно, в случаях новообразований, парезов . А в остальных случаях – от шестого до тридцатого.

Богер

CONIUM ОБЛАСТЬ ВОЗДЕЙСТВИЯ НЕРВНАЯ СИСТЕМА, МЫШЦЫ. ЖЕЛЕЗЫ МОЛОЧНЫЕ; яичники. Половые органы. Дыхание.

ХУЖЕ КОГДА СМОТРИТ НА ДВИЖУЩИЕСЯ ПРЕДМЕТЫ ОТ АЛКОГОЛЯ. Когда поднимает руки. После напряжения. Из-за травмы. Ночью. Из-за сексуальных излишеств. От холода; простуды. От воздержания. В старости. Лежа; с низко опущенной головой.

ЛУЧШЕ Когда больная часть тела свисает вниз.

 

Нерегулярные, беспорядочные проявления, заканчивающиеся нарастающей СЛАБОСТЬЮ, как в старости; одежда мешает, человек падает в обморок во время дефекации, с трудом выговаривает слова, походка неустойчивая и т.д. Дрожит, трясется; выглядит старым. Хроническое течение. Раннее старение, одряхление. Кахексия. Паралич. Внезапная дурнота или слабость; с онемением.

УПЛОТНЕНИЯ: ОРГАНЫ ТВЕРДЫЕ,  КАМЕНЬ [КАМЕНИСТОЙ ПЛОТНОСТИ}. Как будто ком, глыба: в головном мозге, в эпигастрии. Новообразования. Уплотнение, затвердение кровеносных сосудов.

Восходящие симптомы: они распространяются снизу вверх. Рвущая боль. Колет, как кинжалом.

Медлительный. Вялый, апатичный. Застенчивый, но боится оставаться один.

Слабая память. Не в состоянии думать после зрительной нагрузки.

ГОЛОВОКРУЖЕНИЕ, вращательное [системное]; когда ложится, при повороте в постели, от малейшего движения глаз или головы и т.д:

Кажется, что глаза скошены к носу ; веки тяжелые, нависают, особенно в наружных углах глаз. Светобоязнь, фотофобия. Цветное виденье, хроматопсия [все окрашено в какой-либо цвет или цветные пятна перед глазами – Н.Л.].

Ушная сера мягкая, рыхлая. Кислая слюна. Кишечные газы холодные. Запор: стул – через день. Струя мочи прерывается, моча вытекает рывками, лучше мочиться стоя. Яички увеличены. Рези: при выделении спермы, эякуляции; в яичниках, м т.д. Подтекает сок простаты, простаторея; хуже во время стула, от эмоций Семяизвержения, поллюции – от простого прикосновения.

Менструации нерегулярные. Едкие бели.

Мучительный кашель из-за ощущения сухого участка в гортани; из-за щекотания, першения в яремной ямке;

Сердцебиение; хуже от напряжения, от питья, во время стула и т.д.

ЖЕЛЕЗЫ ЗАТВЕРДЕВШИЕ И БОЛЕЗНЕННЫЕ. Молочные железы: узлы на них; покалывание; они напиваются перед менструацией; сморщенные [атрофированные]; в них слишком много молока; ухудшение перед менструацией или при каждом шаге.

Горячие участки на голове. Травмы спинного мозга. Пятки: как будто вылезет наружу; стреляющая боль в них. Кожа зеленоватая, как старый кровоподтек, синяк; на ней пятна; зловонные высыпания или экзема. Тупость, глупость. Ощущение холода в затылке, в икрах и т.д. Приливы жара или пота при засыпании. Потоотделение под глазами на подбородке, в подколенной ямке; холодный пот на задней поверхности шеи или на ладонях.

Минимальная продолжительность действия – 3 недели.
дополняющие. PHOS., Sii.
диф. диагноз. Am., Bar-c, Calc-f., Caust, Gels., lod.[/su_spoiler]

Гранжорж

Человек, который поднимается на гору и у него проблема, так как он хочет взять все сразу на пути (например, врач-аллопат – берет все сразу: фитотерапия, акупунктура, пищевые добавки, Тянь-ши и т.д.), но он не достигает цели, впадает в сексуальность.

Случай. Один доктор уже не мог ходить. Заезжали к нему домой неоднократно, чтобы сделать что-то приятное. Он рассматривал всех девушек с пристрастием, спрашивал, как их зовут. Его называли «старой ракушкой». Однажды он позвонил: «Я потерял одно ухо». Д. Гранжорж быстро приехал к нему домой. У него была серная пробка. Убрать ее, чтобы слух лучше – одно лекарство = Conium. Дал ему это лекарство. Все стало хорошо, он стал и ходить (лекарство это подействовало и на его паралич, ему 85 лет), стал изучать иностранные языки. Вначале итальянский – уехал туда, затем немецкий – уехал в Германию, потом испанский – уехал в Испанию.

Это лекарство еще хорошо назначить, чтобы изучать иностранные языки. Это люди, которые говорят хорошо на всех языках. Если ребенок, которому трудно изучать языки, ему надо дать Conium (15 или 30 СН). Если проблемы с математикой – Baryta carbonica, с литературой – Fluoricum Acidum.

Случай. Собаке 8 лет, ее Д. Гранжорж привез из Африки (Conium). Работа в Африке с маленьким обществом – небольшим населением. Они не умели писать, только разговаривали, но они были очень духовными. Назвал собаку, Жек (а они подумали, что Шеф), поэтому кормили его с тарелок людей за столом, никто его не трогал. Он был очень властный – даже большая собака уходила, а он ел из двух тарелок. Бродил, уходил из дома на 5 дней. Один раз вернулся мокрый, вялый, улегся в свою корзинку (после проблемой с собаками-суками), на следующий день он был парализован. Отвез его к ветеринару – тот сказал, что это старость, его не нужно лечить, а надо усыпить. Забрал, отвез к другому ветеринару. Тот обследовал и обнаружил увеличенную предстательную железу. Назначил операцию. Забрал и у этого ветеринара, а отвез к ветеринару-гомеопату. Усиленная влажность и усиленное диктаторство – назначил Conium 9 СН 3 крупинки = все стало нормально и еще прожил до 16 лет.

Случай. Бабушка имела паралич ног, ездила в коляске. По характеру очень властная и педантичная. Дал ей Conium 30 СН, а сам занялся ребенком этой бабушки. Через год она уже научилась ходить, но стала странной: каждое утро берет Библию и ходит по всем квартирам и всем читает Библию. Она стала пророком.

Conium (Кониум) – он пророк или очень сексуален. Как Петух. Принести Петуха в жертву медицине, иначе Петух – Conium (потому, что он идет искать всех куриц, он будет утром – пророк). Когда что-то важное, Петух поет 3 раза. Петух – это символ Conium, это сознание. С. Ганеман = Петух – это мужчина, который пожертвовал себя медицине. Слушая другого человека, мы познаем себя. Также и мы слушаем пациента, чтобы понять болезнь. С. Ганеман говорил, что нужно записывать даже слова. У него еще и отвращение к печали, так как не может применить себя печали.

Гомеопатический препарат Conium – еще и предменструальный синдром.

Вермюлен

CONIUM MACULATUM
Пятнистый болиголов
НЕРВЫ. МЫШЦЫ. ЖЕЛЕЗЫ [МОЛОЧНЫЕ ЖЕЛЕЗЫ; яичники].
Половые органы. Дыхание.
* ПРАВАЯ СТОРОНА. Левая сторона.
Ухудшение: Когда ВИДИТ ДВИГАЮЩИЕСЯ ОБЪЕКТЫ. АЛКОГОЛЬ.
Когда поднимает руки. После напряжения. Повреждение (травма). Ночь.
Сексуальные излишества; мастурбация. Холод; простуда. Воздержание;
обет безбрачия. Старость. В положении лежа; голова низко. Когда
поворачивается в постели. Вращение глазами. Свет. Во время еды. Молоко.
Снежный воздух; морозный воздух. Когда стоит. ДВИЖЕНИЕ.
Улучшение: Свешивание части тела. Движение пораженной части тела.
НАДАВЛИВАНИЕ. Голодание. Темнота. Ходьба. Когда садится.
ПРОДОЛЖАЮЩЕЕСЯ ДВИЖЕНИЕ.
• – ПОСТЕПЕННЫЙ паралич и слабость в сочетании с уплотнениями:
Психический: постепенное ослабление памяти; притупление всех чувств.
Эмоциональный: безразличие и твердость; материалист с сильной
привязанностью к материальному миру. Из-за своего материализма Con.
впоследствии страдает от потери сексуального партнера.
Физический: уплотнения и опухоли; раковые поражения.
П – Постепенный паралич с МЕДЛЕННЫМ дебютом и для
большинства частей НЕЗАМЕТНЫЙ. «Об этом постепенном ухудшении
будут говорить только после двух-трех визитов, после того как они
действительно испытают подъем энергии и улучшение общего
состояния. Обычно только позже, уже после приема Conium, они видят, как
ограниченны, скованны они были и насколько в настоящее время у
них больше свободы и непосредственности».
П – «Небольшое количество симптомов на эмоциональном уровне и
разновидность ИНТРОВЕРСИИ. Пациент не откровенный…
Недостаточность эмоциональной и психической сферы, приводящая к
слабому эмоциональному и психическому выражению. Объем
эмоционального и психического ответа пациента не пропорционален тому,
который вы ожидаете по его истории. Вы можете увидеть, что в
прошлом этот пациент очень много эмоционально страдал. Вы увидите,
что в прошлом у данного больного отмечалось значительно более
сильное выражение эмоций, чем в настоящий момент».
П – «Постепенное ЗАМЫКАНИЕ В СЕБЕ, приводящее в конечном счете
к изоляции и даже к ОТВРАЩЕНИЮ К КОМПАНИИ. Пациент
постепенно становится все более изолированным и тем не менее не
жалуется на недостаток компании».
П – «Постепенное замыкание в себе, приводящее к ригидности и даже к
ритуальному и компульсивному поведению, особенно
выражающемуся в отношении строгости диеты и отношении к здоровью. Они
развивают твердые концепции, касающиеся здоровья и диеты. Затем
они ограничивают свой пищевой рацион и придерживаются этой
диеты без особых сложностей».
П – «Тип людей, которые удовлетворены своим состоянием. Они имеют и
выражают меньше тревоги, связанной с ситуацией, чем могли бы,
исходя из имеющихся у них предпосылок. Они могут даже выявлять
полное отсутствие тревоги, сталкиваясь с неопределенным будущим
или плохим прогнозом, связанным с их патологией. При первой
беседе они могут не считать себя больными физически и эмоционально
или даже быть ограниченными на этих уровнях70. Большинство
пациентов Conium гордятся своей способностью быть спокойными,
уравновешенными и организованными, как внутренне, так и
внешне, когда противостоят эмоционально изменяющейся ситуации».
П – «Под настоящей картиной препарата скрываются другие
лекарственные средства, более экспрессивные, такие, как Phosphorus, но
фактически, в большинстве случаев это – Tuberculinum… Conium так же
относится к Tuberculinum, как Thuja к Medorrhinum… Связь между
раком и туберкулиническим заболеванием или миазмом. В прошлом
у Conium вы можете увидеть бурную» жизнь, которая, однако,
становится менее интенсивной при развитии патологии Conium.
П _ «Отсутствие сексуального желания… Обычно слышишь, что «секс –
это не самое важное…» Большая часть женщин, поддающихся
лечению Conium, были лесбиянками. У всех у них в прошлом какое-то
время были неудачные взаимоотношения с мужчинами, и обычно
после этого они становились лесбиянками. Все они говорят, что их
сексуальные взаимоотношения с мужчинами не приносили
наслаждения, и используют такие слова, как «болезненные» и «неприятные»
при их описании. Такие же чувства могут быть и у
гетеросексуальных женщин»*.
П – Сильная привязанность к материальному миру, медленно
превращающаяся в безразличие [особенно из-за печали]: «Очень мало заботится о
вещах; делает бесполезные покупки, теряет или портит их» [Phatak].
П – ОТВРАЩЕНИЕ к КОМПАНИИ или ПОСТОРОННИМ во время
МЕНСТРУАЦИИ.
П – «ГОРЕ заканчивается развитием паралича или слабоумия».
П – Отвращение к СВЕТУ; улучшение в темноте. Любит носить темную
одежду; одет, как будто в трауре. Предпочитает темные цвета, даже
только черный.
О – ПРОДОЛЖАЮЩЕЕСЯ движение [3].
О – > НАДАВЛИВАНИЕ [3]. после завтрака [2].
Ф – Головокружение & онемение или скованность в шее [наружное горло].
Ф – Простатит или увеличение предстательной железы & затрудненное
мочеиспускание [напряжение, прерывистая струя мочи, головная боль
и потоотделение от напряжения].
Ф – Тяжелые, опущенные веки,

Похожие материалы…  Kreosotum

Лечение мастопатии методом классической гомеопатии. Роль Conium в лечении тяжелой патологии. Гомеопрофилактика рака.

Врач Деева Лидия Александровна.
Клиника классической Гомеопатии им. С. Ганемана. Москва.

Случай №1 Диффузная мастопатия у кормящей матери, рецидивирующие лактостазы. Хронические головные боли.

Случай №2 Узловая мастопатия у кормящей матери. Рецидивирующие лактостазы. Гипертония.

Случай №3 Узловая мастопатия. Хронический бронхит.

Случай №4 Фиброзно-кистозная мастопатия. Хронический кератит с серьезным нарушением зрения. Хронические головные боли.

Резюме

Что мы можем сказать о раковых и опухолевых процессах? Что это за патология? Очевидно, что это классический пример двух «несходных болезней», о которых говорил С. Ганеман. Очень часто раковая опухоль требует специфического противоракового препарата (органотропного или препарата с ярко выраженной тропностью к определенной опухоли), далее, когда усиливаются симптомы КОНСТИТУЦИИ пациента, а раковая опухоль ослабевает и уменьшается – организм требует конституциональный препарат. Именно этот принцип описан у Самуила Ганемана в «Органон 6 издание». В параграфах 39- 42 идет речь о «несходных заболеваниях», в примечание № 32 к параграфу 40 говорится о том, что невозможно излечить пациента только одним подобным препаратом, необходимо их чередовать, чтобы они воздействовали на одну, а потом на другую «несходные болезни». Этот принцип всецело применим для лечения раковых больных, а так же для лечения тяжелых хронических мультимиазматических  болезней.

Необходимо задать только один вопрос. Сколько времени требуется для того, чтобы в организме сформировался рак? Ведь раковая опухоль не вырастает за несколько месяцев. Онкопроцесс разрушает иммунную систему человека в течение нескольких лет, до того как образуется морфологический субстрат.
Тогда логично будет предположить, что эти «несходные болезни» уже существуют в организме человека на самых ранних доклинических этапах формирования опухоли. Возможно, что увидеть их существование зачастую бывает сложно, поэтому и возникла потребность поговорить сегодня об этой проблеме.
Четыре года назад ко мне за помощью обратился мужчина 40 лет с Диагнозом: Рак яичка. Что самое печальное, что на протяжении 4х лет подряд до возникновения рака он лечился у классического гомеопата.
Когда я посмотрела выписку за все 4 года, то увидела прекрасные назначения! Его лечили его конституциональным препаратом Ликоподиумом по шкале Кента в сверхвысоких потениях. К тому же он несколько раз получал Медорринум ( т.к. вел определенный образ жизни…). Первая мысль у меня была – как такое возможно? Почему гомеопатия не смогла спрофилактировать рак? Возможно не та конституция, но я все проверила, и он оказался типичным Ликоподиумом.
По его отчетам в истории болезни было видно, что основная часть его жалоб уменьшалась на фоне гомеопатического лечения, но не уходили 2 симптома, периодические более сильные или слабые неприятные ощущения и боли в яичках, тяжесть, жжение в яичках. Второй симптом – это периодическая непереносимость алкоголя, то более сильная то менее, но перманентная. Эти 2 симптома никак не менялись на фоне лечения. В итоге у мужчины выросла опухоль в яичке «каменной» плотности, он ее сравнивал по плотности с углом от письменного стола. Что интересно, эти боли в яичке по мере роста опухоли прямопропорционально усиливались, таким образом сигнализируя нам врачам о грядущей беде. В анамнезе у пациента не было травм!
Этот случай меня потряс, и я стала часто задумываться о причине болезни и ее развитии ….

СЛУЧАЙ № 1.

ДИФФУЗНАЯ МАСТОПАТИЯ У КОРМЯЩЕЙ МАТЕРИ, РЕЦИДИВИРУЮЩИЕ ЛАКТОСТАЗЫ. ХРОНИЧЕСКИЕ ГОЛОВНЫЕ БОЛИ. ДЕПРЕССИЯ.

В 2012 году ко мне за помощью обратилась молодая женщина 30 лет, кормящая мать (ребенку на тот момент было 6 месяцев). Она предъявляла жалобы на сильные прокалывающие боли в правой груди, жжение в соске правой груди, прокалывающие боли в правом соске, жалящие боли в правой молочной железе. Боли достаточно сильные, так что пациентка с трудом кормит ребенка грудью. Два раза в неделю в правой груди повторяются лактостазы. Последние два месяца у пациентки стало намного больше молока, так что приходилось дополнительно сцеживаться. Правая грудь всегда плотная, даже после кормления. Женщина сказала, что проблемы с правой грудью у нее были с 15 лет: периодически в ней отмечались боли, правая грудь всегда имела плотную структуру, по сравнению с левой. Последние 3 года пациентка чувствует боль в правом соске при ходьбе, когда не носит бюстгальтер. Правая грудь всегда была болезненна при пальпации и перед месячными болела и наливалась больше, чем левая.
В возрасте 12 лет у женщины была травма правой груди (удар об руль велосипеда).
Женщина крайне встревожена, у нее сильный страх рака, она часто плачет от тревоги. Психологически ей лучше, когда рядом кто-то находится, кто мог бы ее утешить и успокоить.  УЗИ молочных желез: без патологии. Неоднократно консультировалась маммологом, был поставлен диагноз: Мастопатия. Проведенное лечение не оказало эффекта.
Сопутствующие симптомы: в послеродовом периоде у пациентки развилась выраженная общая слабость, она жаловалась, что с трудом заставляет себя ходить по квартире. Пациентка только усилием воли заставляла себя подняться со стула и пройти по квартире в связи с паралитической слабостью в ногах. Женщина несколько раз падала на пол, когда пыталась быстро встать на ноги, встав с кровати утром. Она это описывала так, что ноги «отнимались», как парализованные.

   С подросткового возраста женщину достаточно часто беспокоят тяжелые мигрени, с затяжными приступами, длящиеся по 3 дня, такие сильные, что она не может ходить, вынуждена лежать, приступ всегда сопровождается рвотой, протекает с симптомами повышенного внутричерепного давления. Подобные приступы бывают 1-2 раза в неделю.
  Более подробно о психологическом статусе: с момента родов и до настоящего времени у пациентки наблюдается выраженная депрессия. Она не хочет ни с кем разговаривать, потерян интерес ко всему, тяжелая апатия. Состояние безрадостности. Ее не радует даже собственный ребенок, женщина говорит, что она заставляет себя силой улыбаться, видя своего ребенка, потому что знает, что это ему нужно, на самом деле она не испытывает никаких положительных эмоций. Это состояние психики ее крайне тяготит и на ряду с тяжелым общим самочувствием приводит женщину в полное отчаяние.
            Запоры по 2 дня, иногда трещина ануса. Хроническая многолетняя петехиальная сыпь в области грудной клетки. Всю жизнь пациентка отмечает, что у нее легко образуются синяки (от сильного надавливания). Сильное желание соли. В детстве были носовые кровотечения. В течение жизни периодически ей снятся вещие сны.
           Наследственность: у бабушки туберкулез легких в молодости и рак желудка в 45 лет, умерла в 47 лет. У матери частые пневмонии, миома матки, оперированная фиброаденома молочной железы.


Как мы видим, в реперторизации конкурируют 9 препаратов. С какого из них начинать? Это очень важный вопрос.
В каждом отдельном клиническом случае мы должны правильно расставлять акценты и видеть нужную совокупность симптомов.

Процитирую слова Д.К. Бернетта:

«Точку зрения, что болезнь целиком проявляется симптомами, я принять не могу, так как она не верна. Болезнь может исчерпываться совокупностью симптомов, а может быть и не так. Покрыть совокупность симптомов недостаточно; этим мы выполним лишь полдела. Затем надо ответить на следующие вопросы: какова действительная природа, каков ход развития болезни, какова патология процесса? Какова причина болезни? Причина продолжает действовать или уже прошла? Способно ли выбранное лекарство вызвать болезнь, подобную той, которую мы лечим? Действительно ли оно гомеопатично болезненному процессу, адекватно ли, соответствует ли ему? Будет ли оно действовать до конца? Если нет, мы должны надеяться не на истинное излечение, а лишь на паллиатив…»

Таким образом, мы должны выбрать единственно правильное лекарство, достаточно токсичное по своей природе, имеющее высокое сродство к патологии молочных желез, и даже более того, мы должны искать противораковый препарат. Обратите внимание на то, что у женщины уже много лет отмечаются проблемы с грудью, и на момент обращения они крайне обострились, а именно, после родов, в период резкой гормональной перестройки. Наследственный анамнез только подтверждает опухолевую настороженность: рак желудка у бабушки в молодом возрасте, миома матки и оперированная фиброаденома груди у матери. Скорее всего, если женщину сейчас никак не лечить, ситуация может стать угрожающей по развитию рака молочной железы.
Как мы должны рассматривать случай? Выбирать конституцию или органотропный препарат?
В данном случае правильный ответ, подтвержденный практикой, может быть только один – это специфический противораковый препарат, имеющий высокое сродство к молочной железе.
Нет никаких сомнений в том, что каждый гомеопат, имеющий опыт и достаточные знания, выберет необходимый simillium в данном случае.
Но как быть с клинической депрессией? К этому вопросу мы вернемся.
Однако обратимся к дифференциальной диагностике препаратов.

Phosphorus – это прекрасный препарат, тропный к большинству заболеваний молочных желез. Скорее всего, он является конституциональным препаратом нашей пациентки. Это противораковое лекарство. Его часто назначают в клинике «Санта Кроче», Швейцария, Орселина для лечения раковых пациентов. Почему он обладает противораковым действием? Из-за своей токсичности, которую он проявляет в материальной дозе. Очень часто раковые пациенты имеют конституцию Phosphorus. Но мы должны задать вопрос, справится ли Phosphorus в данной ситуации? Скорее всего нет.

Silicea – это глубокодействующее конституциональное средство. Так же это антипсорик, который может быть показан в качестве дополняющего препарата при лечении хронических болезней, в частности при последствиях вакцинации. Silicea стоит в рубрике рак молочной железы, но далеко не всегда является препаратом выбора. Однако если у пациентки есть явные ключевые симптомы этого лекарства и специфическая особенность течения опухолевого процесса (например, свищи), то можно рассмотреть ее применение. Silicea не является органотропным препаратом для молочной железы. В данном случае нет симптомов, указывающих на то, что Silicea может быть конституцией пациентки.

Sulphur – великий антипсорик, этот препарат стоит почти во всех рубриках реперториума, в том числе и в раковых, однако, он не имеет сродства к патологии молочных желез. В качестве конституции он так же не рассматривается.

Calc-c – механически закрывает некоторые симптомы со стороны груди, а так же общие симптомы. Но патология этого лекарства мягкая, возможно деминерализующего характера. Calc-c может применяться как конституция при наличии мастопатии, болезненном нагрубании молочных желез перед менструацией. Но, это будет всегда двусторонний симметричный процесс. Он всегда более физиологичен и менее опасен. В данном случае мы видим односторонность поражения молочных желез, что говорит о наличии агрессивного заболевания, при котором Calc-c вряд ли показана.

Pulsatilla – так же механически закрывает много симптомов, в том числе, и со стороны молочной железы, а так же стоит в рубрике рак молочной железы во второй степени, но Pulsatilla не обладает высокими разрешающими возможностями в отношении патологии молочных желез и явно не профилактирует развитие рака. В данном случае есть несколько симптомов психики пациентки, которые так красиво описаны у Pulsatilla. Пациентка плачет, желает утешений. Если сделать упор на эти жалобы, то можно ошибочно выбрать Pulsatilla. Нужно избегать излишней психологизации в анализе случаев. У пациентки серьезная проблема, у нее действительно очень плохое самочувствие и сильные боли в груди. Ее плаксивость в этой ситуации, разумеется, оправдана, и, конечно, не может рассматриваться как гомеопатический симптом! Мною заведомо были взяты психические рубрики в общую реперторизацию, чтобы в последствии их опровергнуть.
Пациенты, которым недавно диагностировали рак, прибывают в состоянии горя от своего диагноза, могут часто плакать, страдать бессонницей, терять аппетит и вес, и в подобной ситуации показан препарат Ignatia. Данное лекарство успешно применяется в практике доктора Дарио Спинеди (Швейцария, Локарно, клиника по лечению рака «Санта Кроче»).
Для нас более важны явные достоверные жалобы. Обратите внимание на рубрику – боль в молочной железе при кормлении. Там стоит Pulsatilla, но нет других важных лекарств. У нашей пациентки грудь изменена, сама по себе болезненна, уплотнена, и, конечно, она будет так же болезненна при кормлении. Таким образом, не стоит опираться на эту рубрику в выборе препарата. Дело в том, что реперториум не совершенен. Лишь ясный ум, четкое клиническое мышление и хорошие знание Материи Медика помогут нам в правильном выборе препарата. Механическая реперторизация обрекает нас на неудачу. 

Belladonna и Bryonia — это острые препараты, рассматривать их здесь не уместно. Нам нужен глубокодействующий хронический препарат.

Natrium muriaticum – наша пациентка все время плачет. И он механически набирает много очков. Но его применение в подобных случаях не обосновано, так как Natrium muriaticum не обладает глубоким действием на молочную железу и, к тому же, не является противораковым препаратом. А мы должны искать именно такое лекарство.

Conium – это единственно верный выбор в данном случае. Патология у пациентки остро сконцентрирована в области молочной железы. Conium отвечает за специфические изменения в груди, как правило, в виде затвердения, общего или локального уплотнения. Затвердение молочной железы после ее травмы. Плотные опухоли в молочной железе. Так же для Conium характерна атрофия молочной железы. Весь характер болей в груди, который есть у нашей пациентки соответствует этому препарату – жгучие боли, боли в соске, боли в соске при ходьбе, прокалывающие боли в молочной железе, прокалывающие боли в соске, повышенная секреция молока. Частые лактостазы. Лактостазы в послеродовом периоде. Conium — это великий противораковый препарат, он в полной мере отвечает за различные опухоли, и в большей степени за опухоли молочной железы. Опухоли и рак груди, которые развиваются на фоне последствий травмы груди. Если мы назначаем этот препарат, то в первую очередь занимаемся профилактикой рака. Рак — это агрессивный процесс, который разрушает сначала иммунную систему, и лишь на последней стадии начинается рост опухолей, и уже в этом периоде, к сожалению, процесс часто бывает неуправляемым. Мы врачи-гомеопаты наделены сильным оружием, у нас в руках есть прекрасная наука и серьезные лекарственные препараты, которые, учитывая опыт старых мастеров, способны успешно лечить и профилактировать онкологию. Критерий истинности этих заявлений — чистый опыт и практика. Ниже я опишу в подробностях в какой мере гомеопатия может творить чудеса.

Conium является одним из больших полихрестов, посмотрите, в каких разных рубриках он стоит и какие жалобы покрывает, в частности, со стороны головных болей. Если состояние Conium развивается у пациента, то назначение этого препарата поможет решить множество проблем, не всегда связанных с патологией молочных желез.

Что касается психики пациентки и ярко выраженной депрессии, то мы так же находим ее в описании у Conium. Он стоит в самых тяжелых рубриках психики, отвечающих за депрессию. У Кониума есть суицидальная предрасположенность. И что очень интересно мы находим его в рубрике психики «Отвращение к своим детям в следствии печали». В этой рубрике стоит только один Кониум!
Таким образом этот препарат охватывает самые тяжелые депрессии.

Рассмотрим другие жалобы пациентки.
Паралитическая слабость – Conium
Слабость в ногах – Conium
Хронические головные боли – Conium
Мигрени –Conium
Головные боли со рвотой – Conium
Депрессия. Апатия ко всему
Отвращение к своим детям в следствии печали

У пациентки есть страх рака. Должны ли мы его рассматривать активно при выборе препарата, ведь Conium не отвечает за страх рака? Конечно же нет. В данном случае страх рака оправдан ярко выраженным болевым синдромом и длительной болезненностью груди в прошлом. Переживания женщины закономерны. Это не гомеопатический симптом.

Назначение: Conium1000 однократно.

Отчет через 1 неделю:
Боли в груди стали значительно меньше – улучшение на 70 процентов.
Боли в правом соске уменьшились на 50 процентов.
Правая грудь приобрела более мягкую консистенцию.
Уменьшилась выработка молока до нормы, теперь пациентка не сцеживается.
Головных болей не было целую неделю.
Слабость почти такая же.

Отчет через 1 месяц:
Остаются слабые жалящие боли в правой груди и редкие прокалывающие боли.
Правая грудь стала еще мягче.
За весь месяц не было ни одного застоя молока.
Общая слабость лучше на 30 процентов.
Слабость в ногах меньше на 50 процентов.

Назначение: Conium10 М

Отчет через 1 месяц:
Боли в груди прошли полностью.
Застоев молока нет.
Настроение стало лучше! Пациентка может радоваться при контакте со своим ребенком.
Правая грудь стала еще мягче, сравнялась по структуре с левой. Пациентка отмечает, что в течение всей жизни, с подросткового возраста у нее никогда не было такой мягкой правой молочной железы.
Конечно, подобные улучшения очень обрадовали женщину, и она не верит происходящему с ней, считая это чудом.
За все время был только 1 приступ головной боли, 2 дня назад.
Общая слабость меньше на 70 процентов.
Слабость в ногах меньше на 70 процентов.
Настроение хорошее.
Пациентка больше не плачет и радуется жизни.

Назначение: Conium10 М

Отчет через 1 месяц:
Самочувствие хорошее, слабости нет.
Головные боли беспокоят крайне редко 1 раз в 2 недели и стали слабее по интенсивности.
Болей в груди нет.
Правая грудь стала совсем мягкой, полностью изменилась по структуре, теперь она такая же, как левая.
Настроение стало еще лучше.

Далее в течение года пациентка получала свой базовый конституциональный препарат Phosphorus по шкале Кента.

Через 1 год приема Phosphorus, у пациентки вернулись слабые прокалывающие боли в правой груди, она стала замечать, что пальцы ног часто бывают холодными. Периодически беспокоят покалывания в шейке мочевого пузыря. Головные боли участились на фоне приема Phosphorus.

Назначение: Conium10 М

Отчет через 1 месяц:
Боли в груди ушли полностью.
Головные боли стали реже.
Пальцы ног не мерзнут.

Назначение: Conium10 М.

Отчет через 1 месяц:

Самочувствие хорошее, но в последнее время пациентку беспокоят частые поносы, боли в желудке, опять участились головные боли.

Назначение: Phosphorus1000.

Отчет через 1 месяц:
Самочувствие хорошее, жалоб нет.

Далее в течение года Conium CM, CM.
Потом конституциональный препарат Nat-m.

До настоящего времени пациентка продолжает лечение. Самочувствие на фоне гомеопатического лечения хорошее, жалоб практически нет.

Женщина ведет активный образ жизни, у нее много энергии, она работает. Настроение хорошее! На 5 баллов по 5 бальной шкале. Она благодарна Богу и Гомеопатии за такую чудесную помощь.

СЛУЧАЙ №2.

УЗЛОВАЯ МАСТОПАТИЯ У КОРМЯЩЕЙ МАТЕРИ. РЕЦИДИВИРУЮЩИЕ ЛАКТОСТАЗЫ. АРТЕРИАЛЬНАЯ ГИПЕРТЕНЗИЯ.

Женщина 38 лет кормящая мать (ребенку 5 месяцев), обратилась ко мне за помощью в 2013 году по поводу частых рецидивирующих лактостазов в левой груди, так же лактостазы бывают в правой груди, но значительно реже. Пациентку беспокоят прокалывающие боли в обеих молочных железах.
В возрасте 18 лет у нее был сильный ушиб левой груди, после чего постепенно грудь стала более плотной и со временем в ней образовались 2 достаточно больших плотных узла: первый размером 20 на 20 мм, второй 40 на 40 мм. Пациентка обследована у маммолога. Диагноз: узловая мастопатия. Рекомендации не принесли эффекта. Объективно: при пальпации левая грудь более бугристая по сравнению с правой, с плотными прожилками, пальпируются 2 узловых образования каменной плотности с размытыми краями. Левая грудь всегда болезненная при пальпации.
Сопутствующие жалобы: Последние 10 лет женщина склонна к повышенному АД до 145-150 на 90-100 мм.рт.ст., сопровождающемуся головной болью, что заставляет ее периодически принимать антигипертензивные препараты.
Общая слабость. Слабость в ногах. Головокружения при ходьбе. 
Запоры по 2-3 дня. Хроническая трещина ануса. Желание фруктов. Петехиальная сыпь в области грудной клетки. Всю жизнь склонность к легкому образованию синяков. Потливость ладоней от волнения. Жжение в ладонях. Поллиноз с 18 лет. Раздражительная. Кричит на близких. Гневливая. Сочувствующая. Брезгливая. В течение последних 5 лет ногти на ногах приобрели желтую окраску.
Наследственность: мать — злокачественная гипертония, устойчивая к гипотензивным препаратам с цифрами АД 220 на 110.


Посмотрите на таблицу линейной реперторизации. Практически все жалобы закрывает Phosphorus. Это закономерно, потому что он возможно является конституциональным препаратом. Однако есть 2 рубрики, в которых он не стоит, а именно: плотные опухоли в молочной железе, боль в молочной железе при пальпации.

Однако, так как пациентку достаточно сильно беспокоила трещина ануса, первое назначение было – Phosphorus 1000.

Отчет через 1 месяц:
Общее самочувствие лучше, слабость меньше на 30 процентов.
Ушли прокалывающие боли в груди.
За этот месяц было 2 лактостаза, но они протекали легче.
Артериальное давление стабилизировалось, держится на уровне 125-135 мм.рт.ст.
Трещина ануса практически не беспокоит.
Узлы в молочной железе не изменились, такие же плотные.
Назначение – Phosphorus10М.

Отчет через 1 месяц:

Лактостазы стали беспокоить чаще, за месяц было 5 застоев молока. Грудь стала более болезненной.
Усилилась секреция молока.
Снова появились прокалывающие боли в левой груди.
Приходится сцеживаться после кормления.
Пальпируются такие же плотные узлы в левой молочной железе.
АД имеет тенденцию к повышению, часто в течение месяца 135-145 на 100 мм.рт.ст.

Учитывая многолетнюю желтую окраску ногтей на ногах у нашей пациентки, за которую так же отвечает Conium, выбор этого препарата становится более очевидным. А также мы можем говорить о том, что состояние Conium у женщины сформировалось уже давно. Таким образом онконастороженность в данном случае крайне серьезна.

Назначение: Conium1000.

Отчет через 1 месяц:

Лактостазов не было.
Левая грудь стала более мягкой.
Уплотнения в левой груди уменьшились в 2 раза!
АД стабильное 120-130 на 80-90 мм.рт.ст.
Секреция молока уменьшилась до нормы.
Прокалывающие боли в молочной железе стали реже, но все равно беспокоят.
Назначение: Conium10 М.

Отчет через 1 месяц:

Грудь стала еще мягче, застоев молока нет.
Общее самочувствие хорошее, слабости нет.
АД стабильное.

Назначение: Conium 10М

Далее в течение 1 года пациентка систематически наблюдалась у меня и получала гомеопатическое лечение.

Последний визит в 2016г.

Пациентка закончила кормить ребенка грудью.
Грудь не беспокоит.
Прокалывающих болей в груди нет.
АД стабильное, редко повышается, в основном на смену погоды.
Объективно: при пальпации уплотнения не определяются!

Грудь стала мягкая, полностью поменяла структуру. Пациентка отмечала, что даже когда прибывало молоко, она не могла пропальпировать в ней узлы.

СЛУЧАЙ № 3.

УЗЛОВАЯ МАСТОПАТИЯ. ХРОНИЧЕСКИЙ ОБСТРУКТИВНЫЙ БРОНХИТ. ДЕПРЕССИЯ.

Женщина 45 лет. Монахиня. Обратилась ко мне за помощью весной 2013 года по поводу болезненного уплотнения в правой молочной железе. Уплотнение возникло 1 неделю назад. Я рекомендовала проконсультироваться у маммолога и сделать УЗИ молочных желез, на что женщина согласилась. Вне зависимости от того, что будет выявлено при обследовании, пациентку необходимо лечить, мы не вправе отказывать в помощи. Однако, необходимо серьезно отнестись к выбору гомеопатического препарата.

Жалобы: прокалывающие боли в правой молочной железе «как от электрического разряда». Прокалывающие боли в соске. Жгучие боли в области уплотнения. Образование плотное, болезненное при пальпации. После того, как пациентка пальпирует правую молочную железу, в ней появляется жжение и зуд. Объективно: пальпируется плотное образование в глубине правой молочной железы размером 35 на 35 мм.
Пациентка отрицает факт травмы груди в прошлом.

Сопутствующие жалобы: женщина очень терпеливая и практически ни на что больше не жалуется. Поэтому все последующие жалобы я получила активно задавая вопросы. Последние 6 месяцев у больной нарушилось зрение, появились разноцветные блестящие желто-зеленые круги, огненные зигзаги и пелена перед глазами. Резь в глазах по вечерам. Усилилась фотофобия. Беспокоят головокружения: системные при ходьбе и внезапные в покое.

Выраженная общая слабость, настолько, что пациентка с трудом ходит. Слабость в ногах.
Уже год женщина пребывает в сильной депрессии. Она не хочет жить и с радостью думает о смерти. Пациентку ничего не радует. Она очень замкнутая.
Перенесенные заболевания: хронический бронхит с 20 летнего возраста, обостряющийся 1-2 раза в год по 2-3 месяца. Поллиноз с детства. В раннем детстве носовые кровотечения. Плеврит в 25 лет. Наследственность: у отца туберкулез легких и туберкулезный плеврит, умер в 55 лет.

У пациентки всю жизнь легко образуются синяки. Она плохо переносит голод – возникает слабость и дрожь от голода. Последние 5 лет периодически повышается артериальное давление до 150-160 на 100-110 мм.рт.ст. Часто мерзнут стопы, но в последнее время женщина отмечает, что у нее стали мерзнуть только пальцы ног.

Она сочувствующая. Плохо переносит несправедливость. Любит животных. Очень ответственная. Сильное желание рыбы всю жизнь. Отвращение к сладкому, желание соли.

Конституциональный препарат в данном случае – Phosphorus или Nat-m.

Но последние жалобы пациентки в них не укладываются. Все рубрики последних жалоб закрывает Conium.
Несмотря на тот факт, что женщина не помнит о травме груди, Conium все равно показан. Для того, чтобы назначить этот препарат не обязательно необходимо иметь травму в анамнезе.

Назначение: Conium 10М.

Отчет через 1 неделю:

Боли в груди меньше на 70 процентов.
Опухоль перестала пальпироваться!

Отчет через 1 месяц:

Опухоль не пальпируется!
Боли в молочной железе существенно меньше.

Пациентка сделала УЗИ.
Заключение: множественные мелкие кисты в обеих молочных железах 1-5 мм в диаметре. Консультация маммолога: диагноз ФКМ, рекомендации «Веторон» (витаминный препарат).

Общая слабость лучше на 50 процентов.
Головокружения так же.
Голод переносит так же плохо.
Настроение немного лучше.
Зрение лучше, ушли разноцветные круги перед глазами.
Зигзаги пред глазами стали реже.
Рези в глазах по вечерам ушли.

Назначение: Conium10М.

Отчет через 1 месяц:

Настроение намного лучше. Более жизнерадостная.
Слабости нет.
Головокружения меньше.
Боли в груди ушли полностью.
Зрение хорошее, жалоб нет.
АД стабильное, ни разу не повышалось.
Ухудшилась непереносимость голода, пациентка отмечает, что как только она делает перерыв в еде 4 часа, у нее возникает сильная слабость с предобморочным состоянием и дрожью.

Назначение: Phosphorus1000.

Отчет через 1 месяц:

Самочувствие хорошее.
Голод переносит существенно лучше.

Назначение: Phosphorus 10М.

Отчет через 1 месяц:
Пациентку беспокоит кашель. Обострение ее хронического бронхита. Кашель сухой. Спастический, практически постоянный. Хуже при разговоре, от пения, при смехе. Кашель усиливается при физической нагрузке, при вдохе. Кашель хуже во время ходьбы.  В последнее время повысилась раздражительность и гневливость.
Так как пациентка имеет наследственность, отягощенную по туберкулезу легких, я назначила Tuberculinum 200 однократно, с повтором через 10 дней.

Отчет через 3 недели:

Кашель стал немного легче (на 20 процентов), но опять вернулась сильная слабость.
Периодически бывают головокружения по утрам.
Стали легче появляться синяки. Пациентка отмечает наличие спонтанных экхимозов.

Реперторизация.

Посмотрите, все симптомы закрывает Phosphorus.

Назначение: Phosphorus10 М.

Отчет через 1 неделю:

Кашель стал еще хуже, со спастическим компонентом.
Сильная общая слабость.
Головокружения по утрам.

Понятно, что Phosphorus не работает. Необходимо искать правильное лекарство.
Если мы посмотрим основные рубрики кашля, то становится ясно, что Phosphorus может конкурировать только с Conium. Учитывая, что у пациентки опять вернулась и ухудшилась общая слабость и головокружения, то назначение Conium здесь вполне оправдано.

Назначение: Conium10М.

Отчет через 1 неделю:
Кашель значительно лучше (улучшение на 70 процентов).
Общая слабость лучше на 30 процентов.

Отчет через 1 месяц:

Кашель значительно лучше, но все же периодически беспокоит. Общая слабость меньше. Головокружения возникают реже.

Назначение: Conium10М.

Далее в течение года Conium по шкале Кента 10М, СМ, СМ, СМ.

Далее Конституциональный препарат Nat-m.

В настоящее время пациентка продолжает получать гомеопатическое лечение, на его фоне общее самочувствие хорошее.

За последние 4 года проблем с грудью и бронхитов не было.

СЛУЧАЙ № 4.

ФИБРОЗНО-КИСТОЗНАЯ МАСТОПАТИЯ. ХРОНИЧЕСКИЙ КЕРАТИТ С СЕРЬЕЗНЫМ НАРУШЕНИЕМ ЗРЕНИЯ. ХРОНИЧЕСКИЕ ГОЛОВНЫЕ БОЛИ.

Женщина 55 лет обратилась ко мне за помощью в начале 2015 года по поводу серьезных проблем со зрением. Со слов пациентки, она с юности страдала выраженной миопией (-8; -9), по поводу которой в 2001 году ей была произведена офтальмологическая операция – сделаны насечки на роговице, после которой миопия уменьшилась, но через 5 лет у женщины опять стало прогрессивно снижаться зрение. Неоднократные консультации у офтальмолога и рекомендации в том числе применение гормональных мазей не принесли эффекта. На момент обращения зрение не подлежало коррекции. При офтальмологическом осмотре: насечки на роговице покрасневшие, выглядят воспаленными.
У пациентки достаточно сильные ежедневные ноющие боли в глазах, ощущение песка и режущие боли в глазах.
Зрение в настоящий момент настолько снизилось, что пациентка не может читать в первой половине дня, она не видит буквы. Чтение возможно лишь вечером, но пациентке оно так же дается ей с трудом, что является для нее большим стрессом, так как по профессии она корректор. В последнее время ее охватывает сильный страх, что она может полностью ослепнуть. У пациентки бывают разноцветные голубоватые круги перед глазами.

Женщину беспокоят боли в правой молочной железе, тянущие, иногда жгучие. Редко бывает покалывание в правой груди. Правая грудь болезненная при пальпации. УЗИ: фиброзно-кистозная мастопатия.
В возрасте 40 лет у пациентки была травма правой груди (удар локтем).

Пациентка длительное время с юности страдает тяжелыми, «мучительными» головными болями мигренозного характера, приступ может затягиваться до 3 дней. Головные боли практически ежедневные, пациентка вынуждена постоянно принимать обезболивающие препараты.

У женщины в 50 лет наступил физиологический климакс, длительное время сопровождавшийся маточными кровотечениями. В настоящий момент кровотечений нет, но есть циклические подобно месячным слизисто-кровянистые выделения из влагалища.

Головокружения, системные, при ходьбе, в постели, при поворотах, которые особенно усилились после начала климакса. В последние 5 лет пациентка ощущает «головокружение в затылке».

Несколько лет беспокоят «кусающие» боли в коже по всему телу, которые ухудшились в последнее время.

Выраженная общая слабость. Слабость в ногах: «ноги подкашиваются при ходьбе».
Последние 8 лет прогрессивно снизилась память.

Женщина отмечает, что всегда ее укачивало в транспорте, однако, последние 5 лет укачивание стало настолько сильным, что она не может ездить даже на переднем сидении автомобиля. Возникает тошнота до рвоты и головокружение. Каждую поездку пациентка вынуждена просить неоднократно остановить машину, чтобы выйти на улицу и прийти в себя.
У женщины с детства мерзнут руки и ноги, но в последнее время она отмечает, что холодными стали только пальцы ног.


Назначение: Conium 1000

Отчет через 1 месяц:

Зрение лучше, женщина может спокойно читать. Пациентка отмечает, что боли в глазах стали реже и менее интенсивными, ушли голубые круги пред глазами, ощущение песка в глазах значительно меньше.
Боли в правой молочной железе меньше.
Головные боли стали реже, после приема препарата вовсе не беспокоили в течение 2х недель, потом постепенно вернулись.
Общая слабость так же.
Слабость в ногах без изменений.
Головокружения меньше на 50 процентов.
Кусающие боли в теле без изменений.

Назначение: Conium 10 М.

Отчет через 1.5 месяца:

Зрение стало значительно лучше, пациентка не вспоминает, что когда-то не могла читать.
Боли в глазах ушли полностью.
Боли в правой молочной железе меньше на 70 процентов.
Головокружения менее выражены по интенсивности и отмечаются значительно реже.
Головные боли менее интенсивные, за все время были 4-5 раз, не затяжные продолжительностью 1 день.
Общая слабость меньше.
Память немного лучше (на 30 процентов).
Слабость в ногах периодически бывает.
Слизисто-кровянистых выделений из влагалища не было.
Кусающие боли в теле стали появляться значительно реже (улучшение на 70 процентов).

Назначение: Conium 10 М.

Отчет через 1.5 месяца:

Зрение хорошее.
Болей в глазах нет.
Ощущение песка в глазах прошло.
Боли в правой молочной железе ушли полностью.
Правая грудь стала безболезненной при пальпации.
Головные боли практически не беспокоят. Пациентка говорит, что за все время она пила таблетку от головной боли только один раз.
Общая слабость значительно меньше.
Слабость в ногах была только 2 раза.
Пальцы ног стали теплее.
Память лучше (улучшение на 70 процентов).
Слизисто-кровянистых выделений из влагалища не было.
Кусающие боли в теле ушли полностью.
Пациентке приходилось неоднократно ездить в автомобиле. Она отмечает, что стала намного лучше переносить подобные поездки, за все это время у нее ни разу не было тошноты и других симптомов укачивания. 

Назначение: Conium CM

В настоящий момент пациентка продолжает получать гомеопатическое лечение. Как мы видим, она себя чувствует хорошо.

В данных случаях наглядно продемонстрированы разрешающие возможности Conium и разнообразие сфер его применения.

Подобное всеохватывающее действие на организм может производить только классическая гомеопатия.

Резюме:

Во всех четырех случаях Conium был применен не как органотропный препарат, а в качестве глубокодействующего антимиазматического хронического средства. Традиционно мы редко рассматриваем Conium в качестве лекарства для лечения хронического бронхита, что является ошибочным.
Посмотрите, как часто организм требует этого лекарства, причем для лечения различной патологии. Патология, которая успешно лечится Conium, и была продемонстрирована выше, не ограничивается только мастопатией, а включает заболевания других важных систем органов: хронический бронхит, тяжелые хронические головные боли, проявления гидроцефалии, артериальную гипертензию, разнообразные нарушения зрения, хронические кератиты, общая паралитическая слабость, синдром хронических головокружений и многое другое.

Мы должны стараться видеть симптомы Conium у наших пациентов, должны знать Материю Медика этого важнейшего препарата наизусть, прицельно спрашивать и искать симптомы Conium у своих больных.  Патология Conium многообразна и охватывает многие системы органов. Симптомокомплекс этого препарата может быть выявлен у любого пациента в разные периоды его жизни, что непременно потребует назначения Conium, и, таким образом, будет способствовать излечению ракового диатеза.
Действие Conium на организм сравнимо со своеобразной прививкой от рака. И подтверждение этих слов мы находим в Материи Медика В. Берике: «… Рост опухолей …и раковая предрасположенность»

В качестве цитаты хочу привести слова великого британского гомеопата, произнесенные на онкологической конференции, в чьей практике имеется достаточно случаев успешного лечения и полного излечения рака методом гомеопатии, доктора Р. М. Ле Анте Купера (R. M. Le Hunte Cooper), сына не менее выдающегося британского гомеопата, члена знаменитого Куперовского клуба Роберта Т. Купера (Robert T. Cooper), относительно роли гомеопатии в лечении и профилактике рака:

«Помимо нашего узкого круга весь мир сегодня вопрошает: «Почему попытки лечения рака оказались столь неудачными в прошлом?». Мой ответ таков: «По причине настойчиво внедряемого пропагандированного учения, что раковое заболевание является по существу местной болезнью. Если медицина в целом согласилась бы принять гораздо более обоснованную концепцию конституционального происхождения раковой болезни и лечила бы данное заболевание правильно, руководствуясь в подборе средств лечения сообразно этому принципу гомеопатическим законам, то в будущем мы гораздо меньше бы слышали о неудачах…». … «В начале обсуждения доклада доктора Кларка на Британском гомеопатическом конгрессе в 1924 году я выдвинул в качестве предположения тезис о том, что у пациентов, которых постоянно лечили гомеопатическим способом, другими словами у тех, у которых жизненные защитные силы поддерживались на достаточно высоком уровне (и никакой другой способ не может осуществить это так эффективно), гораздо меньше шансов стать жертвами ракового заболевания. Это, несомненно, обоснованное предположение, поскольку врач-гомеопат лечит пациента, у которого отмечаются симптомы, указывающие на расстройство здоровья, в соответствии с определенными специальными научными принципами, не дожидаясь, пока появится какое-либо видимое органическое или нозологическое заболевание, таким образом устраняя слабое место в сфере защитных сил организма и защищая организм от возникновения любого возможного заболевания.»


Автор: Деева Л.А.

ГОМЕОПАТИЯ. БОЛИГОЛОВ ПЯТНИСТЫЙ (CONIUM. CONIUM MACULATUM)

ГОМЕОПАТИЯ. БОЛИГОЛОВ ПЯТНИСТЫЙ (CONIUM. CONIUM MACULATUM)

Фото: Болиголов пятнистый

БОЛИГОЛОВ (Conium), омег — род растений сем. зонтичных. Двулетние травы с голыми ветвистыми стеблями и перистыми листьями. Известны 4 вида, распространены в Евразии и Африке. В Беларуси встречается болиголов пятнистый, нар. назв. петрушник, обмег ядовитый, свистульник. Растет на опушках, пустырях, в посевах. Стебель его высотой от 60 до 180 см, с красновато-бурыми пятнами на нижней части, с неприятным мышиным запахом особенно при растирании. Цветки белые, в сложных щитковидных зонтиках. Цветет в июне — июле. Плод — вислоплодник. Все растение ядовито, зарегистрированы случаи массового отравления им крупного рогатого скота. Сильная ядовитость растения требует большой осторожности при его применении.

В гомеопатии болиголов прописывают при атеросклеротических явлениях, опухолевидных раздражениях, фиброме матки. В народной медицине препараты из травы и соцветий используют как успокаивающее, противосудорожное и болеутоляющее средство.

Свежие листья болиголова обливают кипятком, помещают в марлевые мешочки и применяют как болеутоляющее средство при ревматизме, подагре и др.


Сродственные лекарства. Belladonna, Hydrastis, Phytolacca

Специфическое действие. На всасывающие и лимфатические сосуды, на железы и органы дыхания; вторично на колсу, слизистую оболочку желудка и кишок, на матку и ее придатки.

Применение. Золотушные заболевания с истощением лсизненной энергии, например, астма и другие заболевания у полсилых особ; расстройства месячных или беременности у золотушных женщин; хронические заболевания желез, преимущественно увеличение и затвердение их; хронические заболевания пищеварительных органов с общим расстройством организма; раковые опухоли; хронические, постоянные и гангренозные изъязвления.

Симптомы

Дыхание. Стесненное и затрудненное дыхание по утрам; короткое, учащенное, тревожное дыхание после малейшего напряжения, иногда с сухим, судорожным кашлем; бурные приступы судорожного кашля или кашля с затяжным шумным вздохом ночью и отхаркивание слизи с полосками крови; сухость и раздражение дыхательного пути, вызывающие кашель; сухой или удушливый кашель; кашель усиливается в постели и продоллсает усиливаться к утру; желтоватая зловонная мокрота, отделяющаяся после приступа кашля.

Наружные покровы. Бледное, сине-багровое лицо; едкий, зловонный пот; похолодение с ощущением внутреннего лсара; пот, как только больной засыпает, продолжающийся в более или менее сильной степени всю ночь; багровая или пунцовая кожа; мелкие белые пузырьки после сильного напряжения, поверхность колеи ярко-красного цвета, горит и зудит; атонические язвы, отделяющие жидкую, кровянистую, зловонную материю; бурые пятна, вызываемые лсаром или работой, с раздражением; лсар, краснота и припухание; опухание и затвердение желез; отек ног; выпадение волос; лишаи на лице с раздражением; прыщи на лбу; болезненные, вялые язвы на лице, в особенности на губах; ощущение холода в глазах после действия на них тока воздуха; желтизна глаз; ячмени; увеличение шейных желез; мокнущие болячки на ногах; пожелтение ногтей и желтые пятна на пальцах рук; постоянная потливость ладоней; мокнущие сыпи с образованием корок; сильнейший зуд около ногтей на руках; ноги обыкновенно холодные или легко зябнут; больной крайне восприимчив к простуде, груди дряблые или твердые и узловатые.

Нервная система. Нервная слабость; неспособность сосредоточить свои мысли; легкое и быстрое опьянение от забродивших напитков, крайняя чувствительность к шуму, больной не переносит разговора с ним или около него; голова тупая, отяжелевшая, как бы свинцовая, в особенности по утрам; головокружение при подъеме с постели и при отходе ко сну; крайнее беспокойство; невозможность долго дерлсать ноги в одном положении; метание; головокружение или дурнота; обморок; улсасные, устрашающие сновидения; болезненная острота обоняния и слуха; различные шумы в ушах, как бы звон колокола, шум колес или отдаленный гром; дурной, горький или кислый привкус; глаза не выносят сильного света, или предметы кажутся движущимися, красными, сильно увеличенными или более отдаленными, чем на самом деле, или они видятся отчетливее обыкновенного, или же видны только наиболее близкие предметы; иногда вместо одного получается несколько изображений; слабость и чувство утомления в коленях; сильнейшая тяжесть, вялость и неловкость в ногах; пальцы рук и ног «замирают» или отнимаются; судороги в икрах.

Месячные. Слабые и прелсдевременные; в промелсутках едкие бели, вызывающие саднение, лсжение и зуд; во время месячных тяжесть внизу и потуги или задержка месячных.

Органы пищеварения и испражнения. Кислая отрылска и изжога; вздутие желудка и кишок после еды, в особенности после молока; громкая отрыжка газами или принятой пищей с кислым, едким, жгучим и царапающим ощущением в горле; холод и саднение в желудке; увеличение брыжеечных желез; урчание и переливание в кишках; постоянная полнота или боль в*кишках; частое, или самопроизвольное мочеиспускание ночью или постоянный позыв; моча светлая и прозрачная или тягучая, клейкая, отходящая с большим усилием и болью; ощущение, как будто что-то сжимает мочевой пузырь, с сильным позывом на мочеиспускание; моча вытекает слабой прерывистой струей; густая, мутная, беловатая моча; длительный запор, с сильным позывом и лсилением; или понос с последующей слабостью, дурнотой, дролсанием и сердцебиением; или понос непереваренной пищей.

Боли. Очень сильные, тяжелые, роющие в груди; ломота в суставах и конечностях, как бы от чрезмерного напряжения; сжимающие боли в разных местах тела; тупые, давящие, оглушающие боли в голове или односторонняя ломота головы; ежедневная головная боль во время запора; сжимающие или резкие боли в желудке; резь в подреберье; давящая, ноющая боль, платье кажется очень тесным; тупая ломота в желудке; напирание вниз или стреляющие боли в матке; ломота в бедрах и пояснице, облегчающаяся при наклоне вперед; ломота и опухание ног; тянущие, ноющие или ушибленные боли в плечах и коленях; стреляющие и рвущие боли в лице по ночам; стреляющие, свербящие боли, предшествующие зуду в уголках глаз; тупая ломота при напряжении глаз.

Сон. Больной к вечеру не может открыть глаза, а ночью спит плохо, так как сон нарушается кошмарными сновидениями; сонливость и нежелание встать с постели по утрам; тупое, тя желое, сонливое состояние в течение дня.

Расположение духа. Крайняя вялость больной равнодушен ко всему; нежелание умствен ного или физического труда; раздражительность и дурное расположение духа; мрачное, угрюмое настроение.

Нос, уши и глаза. Постоянное свербение в носу и чихание или опухание и закладывание ноздрей, в особенности по утрам; скопление серы в ушах или скопление серы и материи; глаза желтые или красные стеклянные, безжизненные, мутные или выпученные.

Десны. Опухшие, кровоточивые, багрового цвета.

Язык. Увеличен; иногда тугоподвижен и болит.

Фото: БОЛИГОЛОВ ПЯТНИСТЫЙ

Conium maculatum (Болиголов пятнистый) | Гомеопатия … и все что с ней связано…

Conium maculatum (Болиголов пятнистый)

Тип — брюзга; нервная система истощена какой-либо изнурительной болезнью, половыми излишествами или онанизмом. Не могут сосредоточиться, потеря интереса к работе и окружающей обстановке, они чувствуют отвращение к обществу и в то же время боятся одиночества. Мозговому истощению сопутствует общая слабость с дрожанием ног, внезапной потерей сил в ногах, шатающейся походкой, неуверенностью и онемением рук, ригидностью суставов. По ночам сильная потливость.
Старики — соответствует старым людям с упадком сил, ипохондрией, с ослабленной памятью и потерей половой силы. Медленная, дрожащая походка, внезапная слабость при ходьбе. Золотушные и раковые больные с увеличенными железами.
Слабость — упадок сил у женщин во время и после климактерия, после острых заболеваний.
Ипохондрия — меланхолическое и ипохондрическое состояние, больной угнетен, особенно старые люди; у старых холостяков и старых дев.
Страх — общества, людей, одиночества.
Голова — ощущение холода в голове; звон, свист и шум.
Головная боль — отупляющие боли по утрам. Сжатие в висках, кажется, что голова разорвется. Ощущение, что в голове инородное тело. Горячие приливы к затылку. Ощущение холода в голове.
Головокружение — усиливается при поворачивании в постели, при легком движении головой или глазами. Головокружения при повороте головы в сторону стоя или лежа. Головокружения у старых женщин, страдающих болезнями яичников и матки. Слабость в ногах, как при параличе. Атаксия.
Инсульт — красное или сине-багровое одутловатое лицо.
Парез — паретическое состояние, которое распространяется снизу вверх.
Сон — сонливость днем.
Память — слабость памяти.
Невралгия — лицевая, на одной стороне; ухудшение от холода, от которого щека опухает и становится темно-красного цвета.
Последствия — тяжелых инфекционных болезней, особенно у старых людей; онанизма.
Уши — обилие болезненной серы темного цвета; она похожа на жеванную бумагу. Свист, звон и шум в ушах.
Глаза — золотушная офтальмия: сильная светобоязнь, непропорциональная по своей тяжести воспалительным явлениям. Боли сильнее ночью, усиливаются от малейшего света, а облегчаются в темноте и от давления.
Язвы роговицы.
Катаракта.
Цилиарная невралгия с болью в глазу и сильной светобоязнью.
Бельмо, образовавшееся вследствие механического повреждения.
Косоглазие — паралич внутренней прямой мышцы глаза.
Веки — птоз.
Ангина — увеличение миндалин с наклонностью к нагноению.
Кашель — сухой, невыносимый, беспрестанный кашель, ухудшающийся при лежании, ночью, у стариков и у лиц с преждевременной старостью. Часто с одышкой и ощущением, будто в горле что-то застряло. Стеснение в груди.
Туберкулез — больной не может отхаркивать мокроту, а должен снова проглатывать ее; мучительный кашель: сухой, болезненный, частый и беспрерывный, особенно по вечерам и ночам, усиливающийся лежа, с охриплостью и болезненностью гортани.
Сердце — слабость сердечной мышцы: пульс то полный и правильный, то мягкий, слабый и неправильный. Сердцебиение после питья.
Атеросклероз — головокружение, дрожание конечностей, слабость, ипохондрическое состояние, слабость памяти.
Потребность — соли, кислого, кофе.
Отвращение — к молоку, которое плохо переносится.
Рвота — «кофейной гущей», с интенсивными болями.
Глотка — судороги глотки.
Отрыжка — кислая отрыжка и изжога.
Изжога — кислая изжога.
Желудок — избыток соляной кислоты; улучшение во время еды; ухудшение через несколько часов после еды. Больной жалуется на кислую отрыжку и изжогу и всегда указывает на болезненное место на уровне грудной кости.
Запор — сопровождается тенезмами. Слабость после стула с чувством обморока.
Понос — испражнения мутные, иногда очень жидкие, нередко с частыми позывами, тенезмами. Сопровождаются коликами и большим вздутием. Испражнения очень зловонны. Стул иногда непроизвольный во время сна. Поносы у слабых и дрожащих стариков.
Цистит — хроническое воспаление с прерывистым истечением мочи. Тщетные позывы на мочу. Гной в моче.
Моча — гной в моче.
Энурез.
Импотенция.
Онанизм — последствия, со слабостью и меланхолией.
Поллюции — от одной мысли или от присутствия женщины.
Простата — аденома: прерывистое истечение мочи.
Менструации — скудные и запаздывающие, непродолжительные, подавленные, с высыпанием по всему телу небольших красных прыщиков. Аменорея после простуды, после опускания рук в холодную воду. Часто боль и спазмы в животе.
Матка — фибромиома матки; боли в матке.
Яичники — плотные опухоли.
Бели — как молоко, густые и разъедающие.
Грудные железы — увеличиваются в объеме и болят при каждой менструации, с ухудшением при ходьбе или малейшем сотрясении. Опухоли желез, даже раковые, часто после удара или сотрясения. Исхудание, увядание желез.
Либидо — желание сохранено, но эрекции слабые или сразу прекращаются.
Ревматизм — ухудшение симптомов в начале движения, облегчение наступает при продолжении движения.
Конечности — дрожь и слабость конечностей.
Онемение — в различных частях тела с ползанием мурашек
Пот — дневные и ночные поты, как только больной заснет или закроет глаза. Холодные стопы и кисти с потливостью при малейшем усилии или при засыпании.
Зябкость — зябкость и постоянный позыв на мочу.
Железы — уплотнение желез до плотности дерева (грудь, яички), особенно после ушиба. Боли или нет совсем, или боль стреляющая, жгучая.
Сыпи — везикулезные сыпи; импетигиозные сыпи на подбородке и волосистой части головы.
Пятна — коричневые, красные, синие или желто-зеленые пятна на коже.
Экзема — сухая и мокнущая, продолжительная.
Зуд — половых частей и всего тела.
Язвы — варикозные язвы со зловонным запахом.
Волосы — выпадение.
Золотуха — золотушная офтальмия, увеличение и уплотнение желез.
Рак — 1) железистых органов (яички, грудные железы, матка): железа плотная, как камень; особенно эффективно, когда образованию опухоли предшествовал ушиб железы;
2) водяной рак (нома): язык и слизистые оболочки опухают и дают вонючее отделяемое; пораженные части пепельного, сероватого цвета и могут даже омертветь. Сильное затруднение глотания вследствие спазма глотки;
3) рак желудка: рвота кровью и серовато-черной массой.
4) рак губы.
Зоб — фиброзный зоб, плотный, особенно у старых и ослабленных с гипо- и гиперфункцией железы. Слабость, тремор, головокружение, потливость с улучшением состояния от еды.
Ухудшение — от холода, покоя, ночью, от физического и психического усилия, от света, от шума, перед и во время менструаций.
Улучшение — от еды и тепла.
Дозы — 3 — 30



КОНИУМ, CONIUM MACULATUM — БОЛИГОЛОВ, ОМЕГ ПЯТНИСТЫЙ. Практическая гомеопатия

Читайте также

Conium

Conium Болиголов пятнистый.Тинктура приготовляется из цветущих верхушек растения, собранных незадолго до созревания плодов, в июле.Патогенез кониум находится в «Хронических болезнях» Ганемана.ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕИмбер-Гурбейр в серии очерков, опубликованных в

CONIUM

CONIUM История болезни 39НЕВРИТ ЗРИТЕЛЬНОГО НЕРВАПятидесятичетырехлетняя госпожа С. пришла ко мне на прием 10 апреля 1924 года за рецептом для астигматических очков.5 марта 1926 года она пришла вновь с жалобами на резкое снижение остроты зрения в последние дни после появления

27. КОНИУМ

27. КОНИУМ Conium maculatum — болиголов пятнистый.Эссенция приготавливается из сока свежего растения. Это так называемое спинномозговое средство. Оно вызывает паралич, идущий снизу вверх. Поэтому это средство против атаксии. Очень характерным признаком этого средства является

БОЛИГОЛОВ (CONIUM. CONIUM MACULATUM)

БОЛИГОЛОВ (CONIUM. CONIUM MACULATUM) Сродственные лекарства. Belladonna, Hydrastis, PhytolaccaСпецифическое действие. На всасывающие и лимфатические сосуды, на железы и органы дыхания; вторично на кожу, слизистую оболочку желудка и кишок, на матку и ее придатки.Применение. Золотушные заболевания с

Conium maculatum. Болиголов пятнистый

Conium maculatum. Болиголов пятнистый Тип кониума — старый человек, с выраженной физической и психической астенией, мышечной слабостью и дрожанием мышц. Полнота, сменяющаяся кахексией на поздних этапах жизни. Характерны головокружения, особенно при повороте в постели, при

Conium maculatum

Conium maculatum Conium/Кониум — болиголов пятнистый Основные лекарственные формы. Гомеопатические гранулы D3, C3, C6 и выше. Капли D3, C3, C6 и выше. Мазь Кониум 5 %. Показания к применению. Головокружения у старых ослабленных лиц, усиливающиеся при смене положения тела, особенно при

Conium

Conium Пятнистый болиголовСтарое средство, ставшее классическим после знаменитого описания Платоном картины смерти Сократа. Вызывает восходящий паралич, заканчивающийся смертью от остановки движений грудной клетки и диафрагмы, — это, так сказать, «заключительный этап»

Geranium maculatum

Geranium maculatum Дикая гераньПривычные мигрени. Профузные кровотечения легочные и из различных органов. Кровавые рвоты. Язвы желудка. Атонические и гнилостные язвы. Летние жалобы.Голова. Головокружения с диплопией; улучшение при закрывании глаз. Птоз, и расширение зрачков.

21. АРОННИК ПЯТНИСТЫЙ

21. АРОННИК ПЯТНИСТЫЙ Травники привозят аронник с Северного Кавказа, из Молдовы, Украины, Западной Грузии, Абхазии.Свежие и высушенные клубни аронника используют в отварах и спиртовых настойках при заболеваниях печени, мочекаменной болезни, ревматизме, геморрое, а также

46. БОЛИГОЛОВ КРАПЧАТЫЙ

46. БОЛИГОЛОВ КРАПЧАТЫЙ Растение очень ядовитое. Древние греки давали приговорённым к смертной казни выпить сок болиголова. Амирдовлат Амасиаци писал о нём: «Это растение нельзя ни есть, ни пить его сок, ибо он лишает человека разума и убивает его. А чтобы уменьшить его

Болиголов крапчатый

Болиголов крапчатый Это двулетнее растение из семейства зонтичных. Еще в Древней Греции использовали его токсические свойства. Преступников, осужденных на смерть, заставляли пить смесь болиголова и опия, после чего наступала смерть. Болиголовом был убит в свое время и

Болиголов пятнистый

Болиголов пятнистый Слабые дозы настоек этого растения, применяемые длительное время, показали действие на молочные железы и кожу. Можно говорить о почти специфическом действии болиголова на грудные железы, в которых рассасываются опухоли и набухание. Целенаправленно

Аронник пятнистый (aram maculatum)

Аронник пятнистый (aram maculatum) Характер: холодныйВкус: сладкийЦвет: корень — коричневый; листья, стебли — темно-зеленые; плоды — красные; цветки — белыеОсновной состав: полисахариды, флавоноиды, крахмал, кумарины, эфирное маслоФармакологическое действие: БАВ растения

Болиголов пятнистый

Болиголов пятнистый Наиболее выраженной противоопухолевой активностью обладают алкалоиды кониин и метилкониин, содержащиеся в болиголове (Conium maculatum L., сем. зонтичных). Препараты на основе болиголова пятнистого используют при различных видах онкологических

Болиголов пятнистый

Болиголов пятнистый Корневище этого растения напоминает хрен, а листья – зелень петрушки. Действующим веществом болиголова является алкалоид кониин, вызывающий паралич двигательных нервов. Для клинической картины отравления характерен паралич ног, при больших дозах

5 ноября Болиголов пятнистый

5 ноября Болиголов пятнистый Настойку болиголова применяют как болеутоляющее и противосудорожное средство. С ним делают припарки к опухолям. Из травы приготавливают ферменты на основе молочной сыворотки.Для этого на 3 л сыворотки берут полстакана травы, стакан сахара,

Цикл Conium maculatum

Цикл Conium maculatum

Гомеопатический журнал Новой Англии
Зима 1997 г., Том 6, № 1

Пол Херску ND, DHANP, MPH с Крисом Райаном MD

Conium maculatum, или Poison Hemlock, был в зелье, убившем Сократа. Сегодня гомеопатический препарат Conium maculatum чаще всего рассматривается в связи с ведущей причиной смерти в современном мире — раком.Но Conium maculatum, , как и любое лекарство из materia medica , имеет более одного лица, более одного потенциального использования и, фактически, полный цикл дополнительных и противоположных характеристик, охватывающий физическое, умственное и эмоциональное домены. Далее следует краткий набросок этого цикла , который, надеюсь, познакомит вас с идеями циклов и сегментов , а затем проиллюстрирует эти идеи на примере одного лекарства.

Я вспоминаю, как лечил одну женщину лет пятидесяти, у которой внезапно развился мастит.Ее правая грудь была очень болезненной и воспаленной. Болезненность была по всей груди, особенно усиливалась от прикосновения или давления, даже от прикосновения к бюстгальтеру или одежде. При пальпации я обнаружил, что на груди было несколько узелков, а сосок втянут. Узелки заполняли всю грудь и доходили до подмышечных желез. Оказалось, что лошадь ударила ее ногой в грудь несколькими месяцами ранее, и через несколько недель она почувствовала себя лучше, но теперь внезапно началось воспаление. Conium maculatum 200C прекратила боли в тот день, а узелки и опухоль уменьшились в течение следующих двух дней; никакого другого лечения не требовалось.

Этот случай иллюстрирует самый известный симптом Conium maculatum — твердые уплотнения по всему телу. Хотя они могут возникать где угодно, они, как правило, возникают в железистой ткани. Распространенной этиологией является повреждение определенного места, после которого начинаются твердые узелки. Что интересно в этом деле, так это вопросы, которые он поднимает.Почему она ответила именно так? Почему у нее образовались узелки? Почему она так отреагировала на травму и почему Conium maculatum имеет такой знаменитый лейтмотив? Почему он производит и лечит так много узелков и опухолей? Ответы на эти вопросы приводят к пониманию лекарства через циклы и сегменты, как упоминалось в предыдущих статьях этого журнала, а также во втором томе Pediatric Materia Medica, Stramonium.

Опухоли / твердые опухоли

Как уже упоминалось, Conium maculatum показан при многих формах опухолей, являясь наиболее заметным сегментом Conium maculatum, и первым, к которому мы обратимся. Conium maculatum известен твердыми, увеличенными, уплотненными наростами, часто обнаруживаемыми в железистой ткани. Обычно поражается грудь, появляются твердые болезненные уплотнения с обеих сторон. Узелки могут быть доброкачественными и возникать в основном перед менструацией, или могут быть злокачественными опухолями. Точно так же узелки могут быть в лимфатических узлах, которые уплотняются вместе с первичным очагом рака.

Conium maculatum у мужчин могут развиться симптомы гипертрофии простаты, когда простата не только увеличена, но и тверда.Яички могут быть твердыми или увеличенными. Любая железа может набухать, уплотняться и образовывать опухоль, но мне интересно, что это, как правило, одни из тех желез, которые больше всего участвуют в сексуальных отношениях с другими людьми — грудь и простата.

Однако есть и другие участки, не связанные с железами, которые также становятся твердыми и / или опухшими. В глазах образуется катаракта, в носу — полипы, живот становится вздутым и твердым.

Хотя на практике встречается реже, люди, нуждающиеся в Conium maculatum , могут описывать симптомы так, как если бы они присутствовали.Они упомянуты здесь, чтобы более подробно показать сегмент цикла. Например, под головной болью можно встретить такие описания, как «ощущение инородного тела под черепом». «Ощущение твердой шишки в мозгу», «ощущение шишки в правой половине мозга». Горло также является прекрасным примером этого: «как будто круглое тело поднимается вверх» или «постоянное желание глотать, как от комка в горле».

Жесткость проявляется на ментальном / эмоциональном уровне в симптомах, которые показывают ригидность или негибкость, или симптомах крайней замкнутости.Такие симптомы, как суеверность или сознательное отношение к пустякам у Conium maculatum , являются примерами своего рода неподвижности мышления. Я вспоминаю одного пациента, у которого все было по-своему. Я лечил его от частых приступов простатита — всякий раз, когда он садился на что-нибудь холодное, у него развивался простатит, полный озноба, пота и головокружения. Во время нашего рассмотрения дела и примерно пяти часов внешних дискуссий я ни разу не смог повлиять на его мысли о чем-либо в жизни.Мы говорили о политике, религии, обществе, воспитании детей, здоровье и многих других вещах, но по каждой из этих тем он имел свое мнение. Он не завидовал моему мнению, но его мнение укоренилось. Некоторое время он довольно интенсивно извергал свои мысли, а затем заканчивал словами: «По крайней мере, я так это вижу». В конечном итоге я воспринял это как форму жесткости, поскольку есть только несколько причин, по которым кто-то может иметь так много сильных мнений и не уступать ни одному из них (например, высокомерие), но для него основной причиной была негибкость.

Они могут выработать устойчивые представления о различных аспектах жизни. Например, определенное питание или особые религиозные убеждения. Этот негибкий характер приводит к знаменитым примерам монашества или присоединения к религиозному ордену. Однако важно понимать, что религия является одним из примеров, но только примером жесткости этого средства правовой защиты.

Еще один интересный симптом, показывающий, насколько они замкнуты, — это эмоции, грусть и неспособность плакать.Этот симптом характерен для Natrum muriaticum и обнаруживается у обоих этих препаратов по одной и той же причине. Оба средства по уважительным причинам становятся настолько закрытыми, настолько защищающими, что не могут получить доступ к своим эмоциям и выразить их. Это блок этих жидкостей, которые наполняют их внутри, подобно тому, как опухает грудь или простата и твердеет. В крайнем случае, мы можем увидеть, как это приводит к неспособности чувствовать и двигаться. Рубрика «Недостаток чувствительности» очень хорошо отражает это состояние, и мы находим Conium maculatum курсивом.

Паралич или крайняя неподвижность — еще один пример процесса выключения. Материя медика описывает функциональное замедление или препятствие для каждой из перечисленных выше уровней твердости. Например, головная боль не только может ощущаться как комок, но и «оглушает», притупляя мысли. Зрение «тусклое» и «близорукое» даже без катаракты, а зрительная адаптация медленная. Глазные мышцы могут быть частично или полностью парализованы, и, в частности, веки могут опускаться, как это видно на примере Gelsemium .Плохой слух, неуклюжая речь («несовершенная артикуляция» из-за тугого опухшего языка), затрудненное глотание, пища спускается в неправильном направлении и останавливается. Наиболее характерен постепенный восходящий паралич конечностей, сначала нижних, затем верхних. Обнаруживаются мышечная слабость, дрожь, неустойчивость при вставании и ходьбе, а также сильная усталость.

Это упрочнение является конечным результатом процесса закрытия и остановки, который начался в предыдущей фазе цикла.Этот вид твердости все больше лишается жизненной силы, поэтому это лекарство имеет тенденцию к раку.

Полный / перегруженный

В Conium maculatum, неизбежным результатом закрытия и удержания является накопление; это полнота и тяжесть. Считаете ли вы это частью фазы удержания, частью фазы опухоли и твердости или аспектом, достойным отдельного рассмотрения, как это делаю я, охватываются одни и те же симптомы. Все места, где может образоваться опухоль, становятся тяжелыми.Во всех местах, где могут быть пробки, мы их найдем. Ощущается тяжесть век, тяжесть в голове, животе и, конечно, конечностях. Полнота груди и вздутие живота, упомянутые в разрезе опухоли, применимы и здесь, разница количественная, а не качественная.

Другим примером застойного, полного состояния из-за этого закрытого статического состояния может быть учащенное сердцебиение в положении лежа — сердцебиение в поисках связи, особенно при вставании и движении.

Недовольство / желание связаться

В опухолевом сегменте он задумчив и чувствует одиночество, но в основном он чувствует себя слишком одиноким, слишком изолированным, и даже при том, что он может бояться других, он сильно желает быть с ними. Это то, что действительно побуждает его быть с другими. Это та часть, которая недовольна своим нынешним окружением, его ситуацией того, как он заканчивается, больным и одиноким, что заставляет его жаждать связи. И это переходный сегмент, который вытеснит их из отключенного сегмента опухоли в активный сегмент.

Активно

Они слишком закрытые и нуждаются в людях. Первобытное желание общаться с другими, которое вызывает всплеск активности или разрядку энергии, быстро выходит за рамки того, что полезно или удобно.

Физически выделения очевидны в большинстве систем лекарства. Слезы текут из глаз, в ушах звенят и гудят, заложенный нос кровоточит или производит гнойные выделения, раздражение горла ночью, в положении лежа, что приводит к спастическому сухому кашлю.Есть рвота и диарея с позывами, но, вероятно, самый известный лейтмотив, который здесь принадлежит, связан с половым влечением. Стремление к сексуальному контакту постоянно растет. В одних это описывается как потребность быть с сексуальным партнером, в других — как сильная потребность в разрядке, в достижении оргазма. Я вспоминаю, как лечил мужчину, который ездил по три часа каждые 10 дней, как по маслу, заниматься сексом со своей девушкой. Он должен был. Если он этого не сделает, если он пропустит один из этих дней, у него разовьется инфекция простаты.Эта интенсивная потребность в контакте становится для них основным побуждением, поскольку они сильно нуждаются в контакте, а затем в разряде, который дает им этот контакт. Я думаю, что это причина того, что Conium maculatum занесен в рубрики, которые имеют следующую неприязнь к людям, но не желают оставаться в одиночестве.

Одно выделение, которое происходит во время или после сегмента опухоли / выключения, проиллюстрировано в знаменитой основной заметке Conium maculatum о поте и приливе жара во время покоя, особенно при засыпании или даже при закрытии глаз.

На ментальном уровне это изменение от слишком малой активности к слишком большой хорошо выражается в человеке, который в одно время грустен и угрюм, а в другое время очень жив, взволнован и счастлив.

Истерия или мания могут занимать их, особенно по работе. Существует множество причин, жалоб и мыслей, которые заставляют пациента вставать с постели или двигаться, но одним из самых высоких среди них является стремление к работе. Это архетипический образ человека, который сублимирует свое сексуальное желание в бурную деятельность.

Но, как и мой пациент, секс — еще одна движущая сила этого пациента. У некоторых из этих пациентов движение наблюдается где-то в другом месте, но у некоторых сексуальные импульсы, сильные желания и образы начинают наполнять его или ее, и они будут беспокоиться, пока не смогут заняться сексом, разрядить себя и соединиться с другим человеком.

Мы также видим открытость и чрезмерную активность, делающие Conium maculatum очень восприимчивыми к травмам. Мы находим травмы, которые приводят к головокружению, слабости и уплотнению всех сегментов, которые последуют за этим.И это повреждение эмоций, подобное горе, которое приводит к следующему сегменту слабости, головокружения и закрытию, подобно Cocculus indica.

Головокружение / головокружение

Симптом, который наиболее точно отражает чрезмерную природу активности, — это «головокружение» Каупертвейта, но самым известным, несомненно, является истинное головокружение, связанное с вращением, которое сопровождает особенно движение, например, когда человек впервые ложится ночью или впервые встает утром. В материале materia medica Conium maculatum имеется значительный диапазон обстоятельств, вызывающих головокружение, но многие из них имеют отношение к движению, демонстрируя эффект всего движения из предыдущего сегмента.Некоторые из них включают движение головы или глаз и шум, особенно разговор других людей, но все они отражают тенденцию к активности, которая вызывает, а затем и последующее желание отключиться. Ухудшение и улучшение состояния Conium maculatum можно рассматривать как часть цикла с ухудшением от видения движущихся объектов, например, когда они слишком много двигаются, как в предыдущем сегменте, и желанием закрыть глаза, что облегчает головокружение. , закрытие глаз приводит к следующему сегменту.

Они стали слабыми и неуверенными в себе. Вероятно, один из самых полезных для нас симптомов — это побег из выделений или оргазм, возникающий при малейшей провокации. Этот симптом иногда связан с наивысшим приоритетом необходимости соединиться с другими или разрядить свои перегруженные себя, но иногда он вызван слабостью, например, Natrum phosphoricum, , когда жидкость уходит по малейшей причине без их воли. Они больше не могут быть уверены в себе.Слабость обнаруживается не только на мышечном уровне, но и во многих областях. Психологически симптомы депрессии, печали или меланхолии, «робость», слабая память и безразличие обнаруживаются в изобилии, особенно после секса или после выделений. Несмотря на интерес, теряется аппетит и снижается сексуальная сила. Общее ухудшение от напряжения, поднятия рук, стоя, сексуальные излишества, старость, ночь — все это можно считать примерами этой слабости.

Интересно отметить, что Conium maculatum указан почти в каждом подрубрике рубрики Общие сведения Движение, как как улучшение / желание двигаться, так и как ухудшение / отвращение к движению.Ранее мы видели, почему возникает желание / улучшение переехать. Именно здесь мы узнаем, почему так много симптомов усиливаются при движении. Точно так же здесь мы находим все ухудшения от учебы и ухудшения от умственного напряжения

Желание закрыть

Способ, которым Conium maculatum борется с головокружением, заключается в том, чтобы начать контролировать себя, отключиться таким образом, который в конечном итоге приведет к негибкой жесткой опухоли, описанной впервые.Быть таким закрытым — это чрезмерная реакция — существенная необходимость отключиться, чтобы принести пользу их общему здоровью. Быть слишком закрытым — это чрезмерная реакция или чрезмерное воспроизведение симптомов, которые были необходимы в первую очередь.

На физическом уровне это стремление к закрытию тела можно увидеть во множестве сужений, таких как: «стеснение, как будто оба виска сжаты», «тенезмы», «глобус», «дисменорея», «схватки». «Сужение подреберья, как от повязки» и «сжатие грудной клетки», и это лишь некоторые из них.

На эмоциональном уровне примеры закрытия в такой манере самозащиты включают отвращение к компании, «нежелание быть рядом с людьми или слышать их разговор». Они также боятся грабителей, я думаю, опять же, по той же причине, что и Natrum muriaticum , избегая компании и опасаясь грабителей — отвращение к нарушению их защитных ограждений.

На ментальном уровне они перестают пользоваться своим умом, они не хотят работать или учиться. Они могут не хотеть делать много, просто хандрить по дому.

Опять же, Conium maculatum, , как и любое другое лекарство, имеет симптомы, которые кажутся противоречащими друг другу. Например, в случае Conium maculatum мы обнаруживаем, что они не только хотят побыть в одиночестве и не любят людей, но также могут бояться одиночества. В прошлом нам приходилось обращать внимание на один из симптомов, а не на другой, или пытаться так или иначе объяснить это кажущееся противоречие, но никогда не давало удовлетворительного результата. Теперь мы можем видеть, что отвращение к компании должно принадлежать этой фазе цикла и что у Conium maculatum должна быть другая фаза, описанная в Vertigo / Головокружение, которая вызывает желание людей.Вот хороший пример того, как анализ лекарств по циклам и сегментам позволяет понять явно конфликтующие или противоречивые рубрики внутри одного лекарства.

Этот сегмент возвращает нас к первому сегменту, который является жестко сжатым и сжатым — сегментом опухолей. Самым известным выражением неблагоприятных последствий сдерживания должно быть знаменитый лейтмотив: «ухудшение от воздержания».

Conium maculatum классически считается первым, когда рак возникает либо после потери сексуального партнера в результате смерти, либо после установления строгого безбрачия по религиозным причинам, т.е.е. поступление в женский монастырь. Если посмотреть на взаимосвязь желания удержаться с образованием опухоли в цикле Conium maculatum , одно следует непосредственно за другим, становится удивительно ясно, как эти два события связаны в жизни.

Итак, в Conium maculatum, есть основное желание, стратегическая потребность держаться крепко, держаться и закрыться. Хотя это может быть, с одной стороны, разумной и понятной человеческой реакцией, но, к сожалению, это начало именно того «слишком закрытого» состояния, в которое мы вошли, в начале данного обсуждения цикла исследования.Если бы активности было достаточно, а не слишком много, то Conium maculatum не нужно было бы так сильно держаться.

Или, с другой стороны, если бы удержания было достаточно, а не слишком сильно, он или она не чувствовали бы себя таким замкнутым и не нуждались бы в активном восстановлении связи. Но когда система делает достаточно, а не слишком мало и не слишком много, у нас нет хронического болезненного состояния и нам не нужно лекарство!

Подводя итог, можно сказать, что Conium maculatum в первую очередь желает быть открытым и соединяться с другими, но не может эффективно поддерживать это.Движение в направлении открытости, как правило, приводит к чрезмерному развитию, характеризующемуся головокружением и потоотделением, на что человек реагирует закрытием, но слишком частым закрытием, что приводит к параличу или развитию жесткого образа мыслей, эмоционального или физического состояния. Это жесткое одиночество невыносимо и побуждает их к желанию быть с другими, и цикл возобновляется.

Чтобы узнать больше о циклах и сегментах, нажмите здесь

Пол Херску Н.Д., DHANP — автор книги «Гомеопатическое лечение детей и страмониум с введением в циклы и сегменты».Он является основателем и издателем этого журнала и главным инструктором Школы гомеопатии Новой Англии. Он практикует, преподает и пишет из Амхерста, Массачусетс.

Крис Райан, доктор медицины, практикует в Бостоне, штат Массачусетс, и прошел курсы повышения квалификации NESH I, II, а в настоящее время — последипломные курсы NESH.

Взаимодействие лекарственного средства и ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств с ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдокогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо такое противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H 2 DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки

HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) собирали из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с окружающим кислородом и 5% -ным уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с необходимым количеством клеток и оставляли для прикрепления в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 3 клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS оценивали количественно после инкубации в течение 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации контролировали и обрабатывали (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блоттинг

клеток HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 5 клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств и ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и снижение жизнеспособности других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке конием 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке конием 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium, с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отделением клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе 450 мкг / мл Conium.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечный график свидетельствует о наличии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе.

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводили путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию некоторых белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt снизились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств и ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α представляет собой фактор или рецептор, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем уровне [29]. Наши результаты показали повышающую регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в его нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие лекарственного средства и ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств с ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдокогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо такое противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H 2 DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки

HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) собирали из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с окружающим кислородом и 5% -ным уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с необходимым количеством клеток и оставляли для прикрепления в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 3 клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS оценивали количественно после инкубации в течение 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации контролировали и обрабатывали (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блоттинг

клеток HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 5 клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств и ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и снижение жизнеспособности других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке конием 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке конием 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium, с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отделением клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе 450 мкг / мл Conium.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечный график свидетельствует о наличии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе.

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводили путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию некоторых белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt снизились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств и ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α представляет собой фактор или рецептор, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем уровне [29]. Наши результаты показали повышающую регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в его нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие лекарственного средства и ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств с ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдокогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо такое противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H 2 DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки

HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) собирали из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с окружающим кислородом и 5% -ным уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с необходимым количеством клеток и оставляли для прикрепления в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 3 клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS оценивали количественно после инкубации в течение 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации контролировали и обрабатывали (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блоттинг

клеток HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 5 клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств и ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и снижение жизнеспособности других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке конием 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке конием 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium, с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отделением клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе 450 мкг / мл Conium.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечный график свидетельствует о наличии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе.

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводили путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию некоторых белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt снизились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств и ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α представляет собой фактор или рецептор, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем уровне [29]. Наши результаты показали повышающую регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в его нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие лекарственного средства и ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств с ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдокогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо такое противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H 2 DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки

HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) собирали из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с окружающим кислородом и 5% -ным уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с необходимым количеством клеток и оставляли для прикрепления в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 3 клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS оценивали количественно после инкубации в течение 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации контролировали и обрабатывали (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блоттинг

клеток HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 5 клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств и ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и снижение жизнеспособности других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке конием 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке конием 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium, с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отделением клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе 450 мкг / мл Conium.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечный график свидетельствует о наличии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе.

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводили путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию некоторых белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt снизились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств и ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α представляет собой фактор или рецептор, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем уровне [29]. Наши результаты показали повышающую регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в его нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие лекарственного средства и ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств с ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдокогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо такое противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H 2 DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки

HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) собирали из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с окружающим кислородом и 5% -ным уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с необходимым количеством клеток и оставляли для прикрепления в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 3 клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS оценивали количественно после инкубации в течение 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации контролировали и обрабатывали (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блоттинг

клеток HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 5 клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств и ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и снижение жизнеспособности других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке конием 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке конием 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium, с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отделением клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе 450 мкг / мл Conium.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечный график свидетельствует о наличии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе.

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводили путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию некоторых белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt снизились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств и ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α представляет собой фактор или рецептор, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем уровне [29]. Наши результаты показали повышающую регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в его нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Conium maculatum — Национальный центр гомеопатии

Естественная история.
Conium maculatum.
Ядовитая тсуга. N.O. Umbelliferæ.
Настойка свежего цветочного растения.

Клиническая.
Asthma.
Воспаление мочевого пузыря.
Поражение груди болезненное.
Бронхит.
Синяки.
Рак.
Катаракта.
Хорея.
Кашель.
Депрессия духов.
Дифтерийный паралич.
Дисмения (перепончатая).
Рожа.
Глаза, болезни.
Галакторея.
Герпес.
Ипохондрия.
Желтуха.
Печень увеличена.
Меланхолия.
Менструация нарушенная.
Онемение.
Поражение яичников.
Паралич Лэндри.
Перитонит.
Phthisis.
Беременность, болезненность груди во время.
Простатит.
Ptoses.
Золотуха.
Сперматорея.
Бесплодие.
Поражение желудка.
Поражения яичек.
Теттеры.
Тризм.
Опухоль.
Язвы.
Vertigo.
Зрение нарушенное.
Венс.

Характеристики.
Согласно Hahnemann Con. является одним из тех лекарств, у которых чрезвычайно трудно различить первичные и вторичные эффекты.
Тем не менее он думает, что первичным действием является «жесткость, уплотнение и сжатие волокон с набуханием желез и ослаблением чувств.«В этом Тесте соглашается, добавляя, что действие в первую очередь воспалительное, и это объясняет его пригодность для« людей с живым, быстрым, жизнерадостным нравом, с заметным развитием железистой системы », и объясняет, почему оно характерно адаптировано. к болезненным поражениям желез, «главным образом в результате напряжения или удара, но точная причина которых, возможно, ускользнула от наших воспоминаний». Teste ставит Con. во главе аналогов Acon. Это для желез и капиллярной системы какой Acon.для сердца и артериальной системы.
Во многих случаях Con. можно рассматривать как «Аконит хронических заболеваний». Другими аналогами аконита, по словам автора, являются Cham., Seneg., Canth. И Ph-ac. Против. соответствует хроническому или подострому воспалению с кровянистым нагрубанием паренхимы, уплотнением и даже последующим изъязвлением тканей.
Туя представляет собой медленную и прогрессирующую гипертрофию определенных тканей, определенных составляющих наших органов.
Стерк использовал Conium в своей героической манере и сделал с ним несколько заметных лекарств от скиррозных опухолей, изъязвлений и других заболеваний, но именно Ганеман первым показал, как это лекарство можно использовать как безопасно, так и эффективно.
Guernsey пишет: «Это лекарство характеризуется сильным головокружением, возникающим, когда он ложится, и очень слегка двигает головой или даже глазами — все содержимое комнаты, кажется, кружится, пациент хочет сохранить голову.
При мочеиспускании вода сначала течет полной струей, затем останавливается, снова течет, снова останавливается и т. д.
Нэш иллюстрирует модальность: ухудшение при движении головой.
Он думает, что «поворот головы набок» — наиболее характерная его форма.
Некоторые считают, что это «лечь в кровать и перевернуться», но он считает «лежание» наименее важной частью.
Он вылечил пациента, у которого были все симптомы локомоторной атаксии и который не мог при ходьбе поворачивать голову вбок, не шатаясь и не падая.
Случай люмбаго был вылечен с помощью Con. Через шесть дней, после семи месяцев страданий, появляется этот симптом: не может переворачиваться в постели без головокружения.
Ухудшение при подъеме от упражнений.
Ощущение, как мяч надавливает на спину над левым бедром, боль, простреливающая в левую ногу, заканчивающаяся пятном, которое ощущается как будто уколот пучком горячих игл.
В разделе «Ощущения» Гернси дает следующее: «Изжога, например, у беременных, когда возникает сильная изжога, когда ложится спать ночью.
Приступы болезненного самочувствия.
Ощущение, будто обруч, повязка или что-то тесное. вокруг частей
Недостаток раздражительности тела, тело имеет очень слабую чувствительность.
Стремительное движение изнутри наружу, напряжение во внутренних и внешних частях, колющие боли в костях. «В костях». Еще один симптом — «желтые ногти». Proell (H. W., XXX. 541) упоминает об использовании Con. который иллюстрирует симптом: «Прерывистый поток». У него были отличные результаты с Con. 10 при странгурии и задержке мочи, когда не удается отвести мочу, из-за нервозности или отека простаты. (Nat-s. 5 trit. Был эффективен там, где нельзя было полностью опорожнить мочевой пузырь.) Con. Оказывает очень выраженное действие на органы малого таза.
Запор очень выражен, или может быть диарея.
Обморок после стула.
Жжение или холод в прямой кишке.
Сиркар записал (Calcutta j. Of Med., Май 1896 г.) поразительный случай, иллюстрирующий последнее.
У пациента был сильный понос, из-за которого врач собирался дать Sulph., Когда он спросил, горячий ли стул.
«Напротив, они холодные», — ответила больная.
Сиркар обнаружил «холодный метеоризм» при Con., и дал это по аналогии с блестящим эффектом.
О сексуальной сфере Con. Обладает глубоким действием, часто встречается с довольно противоречивыми состояниями — гипертрофией или атрофией желез, нарушением функции или прекращением действия.
«Неудовлетворенное половое влечение» является очень важным признаком, и связанные с этим страдания у обоих полов эффективно смягчаются Кон. Я очень хорошо использовал это лекарство в бесчисленных случаях слабости от мастурбации у мужчин и молодежи.
«Излучение при малейшем раздражении, например, просто пребывании в обществе женщины» очень типично.
Многим «помолвленным» молодым людям лекарство помогло.
Это больше соответствует скудным менструациям, чем наоборот.
Гудно (Hoyne’s Theurapeutics-Amer. Hom., XXI. 386) вылечил 25-летнюю девушку от тяжелой дисмении (которая существовала с начала менструации) с скудным, почти остановленным течением.
У нее также было носовое кровотечение, кашель и временами колющие боли в левом легком.
Двумя годами ранее, после необычного возбуждения, у нее были тянущие боли, пролапс и антеверсия.
Боли при дисмении уменьшились с помощью Sepia и других средств, но пролапс усилился с надавливанием, как если бы матка была вытеснена из вульвы, ухудшение при стоянии и ходьбе перед и во время менструации, прерывистое мочеиспускание, рези после мочеиспускания, упорство длительный запор, стул (один раз в семь дней) обильный, твердый, за которым следует трепетная слабость, она должна лечь, тупая боль под левой молочной железой.
Быстрое облегчение и быстрое излечение были произведены Con. 1М.Показанием является скудная менструация (особенно у старых дев).
Проверенные лохии.
Боль в груди перед менструацией, усиливающаяся на каждом шагу, является убедительным показанием для Con. Также все последствия травм груди в результате падений или ударов.
После удара в грудь курсом Кон. всегда следует отдавать.
Нэш упоминает еще одну характеристику Con: «Потеет днем ​​или ночью, как только человек засыпает или даже при закрытии глаз». Это позволило Липпе вылечить 80-летнего мужчину от гемиплегии.
Р. К. Маркхэм вылечил с помощью Con. 1М. упорный кашель, сухой, жесткий, частый, с астматическим хрипом или тонким хрипом в груди при глубоком дыхании, ухудшение от малейшего воздействия холодного воздуха, попадания в холодную постель или из теплой постели или даже вытягивания рук было достаточно для при сильном кашле.
Ведущий симптом, появившийся последним и приведший к лекарству, был следующим: «Боль в верхушке левого легкого с болезненностью в небольшом пятне, на полпути между шеей и плечом, сразу за ключицей.
Боль, режущая и колющая, бежала вниз и внутрь к грудины.
А. Х. Бердсолл сообщает о случае ушиба яичка.
Он обнаружил, что пациент корчится в агонии, боль жаловалась на то, что она «острая, режущая, поднимается вверх по семенному канатику к нижней части спины, а также через мошонку к корню полового члена. К концу двадцати минут боль исчезла (HP, ix. 190.) Conium, соответствует: светловолосым людям, пожилым людям, старым, немощным мужчинам, старым девицам и холостякам, женщинам с жесткими волокнами и легко возбуждаемым женщинам, а также люди с противоположным темпераментом, люди с сильным, сидячим образом жизни, больше, чем живые, стройные люди и дети, люди, которые легко отравляются стимуляторами, женщины со скудными менструациями, скрофулезной конституцией, раком и увеличенными железами.
Последствия ударов или падений, последствия горя, чрезмерной учебы.
Пациенты, которым хуже в простое.
Говорят, что Conium был и почти наверняка был тем ядом, которым был казнен Сократа, и был ли это случай восходящего паралича, который произошел при его отравлении, является показанием для Conium. Ощущение онемения, неспособность поддерживать умственное усилие, слабая память, ощущение усталости в мозгу, слабоумие.
Горячие точки на голове.
Рожа, пронизывающая боль в мозг.
Красное зрение.
Слабость, дрожь и сердцебиение после каждого опорожнения.
Ощущение нереальности происходящего, как во сне.
Безумие, периодическое или попеременное.
Головокружение, усиливающееся при повороте в постели.
Накопление ушной серы.
Тяга к соли, кофе и кислому.
Наблюдается та же склонность к метеоризму, что и у его родственников Ammoniac и Asafetida.
Онемение и омертвение конечностей.
Колющие боли — отличное показание для Conium.Слабые приступы, обморок, внезапная потеря силы при ходьбе.
Пароксизмы истерии и ипохондрии от воздержания от полового акта.
Пациенты с туберкулезом не могут откашливаться, должны глотать мокроту.
Глазные симптомы очень выражены: светобоязнь, птоз и т. Д.
Эти симптомы усиливаются ночью и рано утром.
Большинство симптомов проявляются в состоянии покоя, особенно ночью и при периодических приступах, некоторые при ходьбе на свежем воздухе.
Ухудшение во время еды, в положении стоя, в положении лежа (кашель), в состоянии покоя, при поднятии пораженной части тела, при повороте в постели (головокружение), при очень малом движении головой, при повороте головы в стороны.
Улучшение в темноте, когда пораженная конечность свисает, от движения, при ходьбе, при наклоне.
Отвращение к свежему воздуху.
Желание тепла, особенно солнца.
Обязанность простудиться от малейшего воздействия на ноги.
Сильная предрасположенность к простуде.
Ночной и утренний пот с неприятным запахом и жжением в коже или неприятным запахом без пота.
Ухудшение прикосновения, не переносит давления тесной одежды.
Ясновидение, шок или хуже от падения.

Отношения.
Conium следует сравнить с Aethusa, Oena, Phel., Petros., Ammoniac., Asaf. И другими Umbelliferæ.
Противоядие от него получают: Coff., Dulc., Nit-ac. И Nit-s-d.
Противоядия: Merc., Nit-ac., Sulph.
Совместимость: Arn., Ars., Bell., Calc., Lyc., Nux-v., Phos., Puls., Rhus, Stram.
Несовместимо: я иногда обнаруживал Con. не согласны с пациентами, которые принимали Псор.
Сравните: при отеке и болезненности груди до и во время менструации Calc. (Con. Предшествует Calc. И хорошо следует за Calc. У субъектов с скудными менструациями, Bell. Соответствует Cal. В других отношениях), при скудных менструациях, Graph., При подавлении лохий, Nux-v., Hyos., Puls. , Sec., Как во сне, Ambra, Anac., Calc., Can-i., Stram., Восходящий паралич, Hydr-ac., Mang. (нисходящий, Merc.), паралич, постдифтеритический, Gels., сексуальная меланхолия, Zinc-ox., головокружение при повороте в постели, Sil. (Sil. Испытывает головокружение при повороте налево в положении лежа), хуже от начала движения, лучше от продолжительного движения, Rhus, ушиб желез, Sul-ac. Импотенция, Phos., Слабость после дефекации, Phos. (наиболее отмечен), Nux-v.

Причинная связь.
Ушибы.
Дует.
Горе.
Сексуальный избыток.
Половое воздержание.
Волнение.
Чрезмерная работа.
Снежный воздух.
Весна.

Mind.
Истерические страдания с грустью и сильной склонностью к слезам из-за подавления или из-за слишком свободного снисхождения полового влечения.
Антропофобия и все же страх одиночества.
Робость характера (боязнь грабителей).
Суеверные идеи.
Настроение бояться.
Дурное настроение и угрюмость.
Ипохондрическое безразличие.
Нехватка умственной энергии.
Неспособность к труду.
Раздражительность и склонность к гневу.
Безумие и мания.
Путаница мыслей, как от сонливости.
Замедление зачатия.
Слабость интеллектуальных способностей и памяти.
Готовая забывчивость, чрезмерное затруднение вспоминания вещей.
Бред.

Зав.
Отравление после употребления минимального количества спиртного, даже вина и воды в небольших количествах отравляет его.
Головокружение при повороте в постели; ощущение, будто кровать плывет.
Вихревое головокружение при вставании, а иногда и при падении, вбок, при взгляде назад (при осмотре) или при лежании в постели, особенно по утрам.
Приступы головной боли с тошнотой и рвотой слизью.
Стреляющая боль, особенно в макушке.
Отупляющие боли в голове, особенно при ходьбе на свежем воздухе, сначала в передней части головы, затем в задней части, с насморком, облегчающимся при наклоне и движении головой.
Чрезмерная чувствительность мозга даже к разговору и любому другому шуму.
Quotidian головная боль из-за недостаточной эвакуации.
Полу-боковые боли в голове, как от ушиба.
Рвущая боль в висках и по бокам головы с ощущением, будто мозг засыпает, хуже от контакта, движения и после еды, лучше в положении лежа или при наклоне.
Головная боль, как если бы голова была разбита на куски или могла быть раздавлена.
Давление вниз, как от камня на верхней части лобной кости.
Колющая боль в голове при кашле.
Ощущение, будто в голове большой посторонний предмет.
Тяжесть и ощущение полноты в голове, особенно при пробуждении утром.
Тянущая боль в голове с онемением мозга.
Гидроцефалия: боли усиливаются при пробуждении после еды, на свежем воздухе, лучше от внешнего давления, в положении лежа и при закрытии глаз.
Приступ рвущейся головной боли, заставляющей пациента лечь.
Упорные стреляющие боли в голени, которые, кажется, проходят через лоб.
Горячий прилив в затылке, затем в голове.
Тяжесть и сжимающая боль, словно когтем, во лбу, будто исходящая из желудка.
Апоплексия с параличом (у пожилых людей).
Выпадение волос.

Глаза.
Боль в глазах при чтении.
Зуд под глазами с жгучей и острой болью при их растирании.
Зуд, стреляющая или жгучая боль во внутреннем уголке глаз.
Ощущение холода или жжения в глазах при ходьбе на свежем воздухе.
Боль, словно жжение в глазах, с ноющей болью в глазницах по вечерам.
Воспаление и покраснение склеротической ткани.
Гордеолум.
(Пятна на роговице.)
Катаракта от ушиба.
Близорукость.
Желтый цвет склеротики.
Глаза тусклые.
Глаза выпуклые.
Трепетный взгляд.
Затмение зрения.
Мгновенная слепота днем ​​при ярком солнце.
Близорукость.
Пресбиопия.
Diplopia.
Во время чтения строки движутся.
Черные пятна и цветные полосы перед взглядом, в комнате.
Красный внешний вид предметов.
Ослепление при дневном свете.
Отвращение к свету без воспаления глаз.
Светобоязнь с бледно-красным цветом глазного яблока.

Уши.
Слезы и стреляющие боли в ушах и вокруг ушей, особенно при ходьбе на свежем воздухе.
Скопление серы, напоминающей заплесневелую бумагу, смешанную с гнойной слизью.
Сера кровавого цвета.
Рев и гудение в обоих ушах.
Жужжание, звон и урчание в ушах.
Болезненная чувствительность слуха.
Ухудшение слуха, прекращающееся после удаления серы и до тех пор, пока она не восстановится.
Набухание и уплотнение околоушных желез.

Нос.
Отек ноздрей.
В течение нескольких дней кончик носа толстый, красный, горячий, болезненный, хуже с левой стороны, позже с левой стороны губы появился желтый пузырь, полный гноя.
Гнойные выделения из носа.
Носовое кровотечение, частое при чихании.
Повышенная острота обоняния.
Слишком частое чихание.
Мучительное ощущение сухости в носу.
Упорная заложенность ноздрей.
Заложенность носа по утрам.

Лицо.
Жар в лицо.
Цвет лица болезненный, бледный и синеватый, иногда даже с отеком лица.
Трещины на коже лица с болью, как от экскориации после мытья и протирания.
Ночные боли в лице, рвущие и стреляющие.
Зуд, высыпания, язвы и грызуны на лице.
Влажный и распространяющийся герпес на лице.
Высыпания прыщей на лбу.
Сухость и шелушение губ.
Волдыри и язвы на губах.
Раковая язва на губе (от давления трубы).
Спастическое сжатие челюстей.
Шлифовка зубов.

Зуб.
Одонталгия, обычно тянущая, вызванная прогулкой на свежем воздухе или вызываемая в полых зубах холодной пищей.
Стрельба, рывки, грызение и прокалывание зубов.
Десны опухшие, кровоточащие и кровоточащие.

Устье.
Сухость во рту и горле или слюноотделение.
Смущенная речь.
Язык жесткий, болезненный, опухший, сухой, покрытый грязной слизью.
Ужасно зловонный язык.
(Рак языка).

Горло.
Боль в горле, как от клубка (globus hystericus), поднимающегося из эпигастрия.
Затруднение глотания.
Непроизвольное глотание, особенно при ходьбе на ветру.
Постоянное желание сглотнуть при ходьбе против ветра.
Спазмы в пищеводе.
Царапание в горле.
Спастическое сужение горла.

Аппетит.
Горечь во рту и в горле.
Гнилостный или кислый привкус во рту.
Полное отсутствие аппетита и сильная слабость пищеварения.
Хлеб не портится и не радует вкусом.
Булимы.
Желание кофе, кислой или соленой пищи.
Во время еды, особенно после приема молочной пищи, ощущение вздутия в желудке и животе и быстрое насыщение.
После еды кислый вкус, изжога, давление и переполнение желудка, подъемы, колики, метеоризм, тошнота, мертвенность в пальцах, слабость, утомляемость и пот.

Желудок.
Подъемы пустые, частые и шумные, иногда в течение всего дня.
Неудачные вставания с ощущением полноты в полости горла.
Рис, со вкусом еды.
Подавление отрыжки с последующей болью в желудке.
Изжог, поднимающийся вверх в горло, иногда после еды.
Кислотная отрыжка, особенно после еды.
Тошнота со склонностью к рвоте и полной потерей аппетита или же с отрыжкой и усталостью.
Тошнота после каждого приема пищи или вечером.
Тошнота и рвота при беременности.
Рвота слизью.
Давление в желудке даже во время еды.
Вздутие желудка.
Спазматическая схваткообразная боль, прострелы и боли, как от экскориации, в желудке и эпигастрии.
Ощущение болезненности и саднения в желудке и животе при ходьбе по камням.
Боль с ощущением холода в желудке.

Живот.
После приема молока ощущение вздутия живота.
Тяжелая боль в подреберье, словно от туго затянутой повязки.
Твердость живота от набухания брыжеечных желез.
Давление, тяга, разрывы и прострелы в области печени.
Ланцинация в левом подреберье, даже утром в постели, со стеснением.
Проколы в животе, как будто в него воткнули нож, колющие боли в селезенке.
Полнота живота даже по утрам при пробуждении.
Набухание брыжеечных желез.
Сокращение живота со стеснением.
Спастическая колика.
Резкие и рвущие боли в животе.
Передвижение и копание в пупочной области.
Ощущение экскориации в животе, особенно при ходьбе по тротуару.
Шум и урчание в животе.
Изгнание холодного ветра с черенками.
Задержание газов.
Черенки при отхождении газов.

Стул и анус.
Запор с тенезмами.
Постоянные позывы без стула.
Тяжелая эвакуация, только раз в два дня.
Твердый стул с тенезмами (головная боль, отхождение простатической жидкости).
Сыпучие непереваренные отходы с черенками и частыми подъемами.
Ослабляющий понос.
(непереваренный стул с коликами).
Проколы в заднем проходе.
Жар и ощущение жжения в прямой кишке при опорожнении и в другое время.
Зловонный или холодный метеоризм (ощущение холода в стуле).
Кал с прожилками крови.
После опорожнения кишечника слабость, учащенное сердцебиение, частое изгнание газов и дрожь.
Непроизвольное отхождение кала во время сна.

Мочевыводящие органы.
Давление на мочевой пузырь, как будто моча будет выделять насилие (с колющими швами), хуже при ходьбе, лучше при сидении.
Ночью частое, а иногда и непроизвольное мочеиспускание.
Вытекание мочи, сопровождающееся сильной болью.
Моча густая, белая и мутная.
Моча красная.
Задержка мочи.
Затрудненное отхождение мочи, которая течет только по каплям.
Ночное мочеиспускание.
Смачивание постели.
Диабет, сопровождающийся сильной болью.
Частое желание выделять мочу прозрачную и водянистую.
Вязкая слизь, смешанная с мочой, которая не может пройти без сильной боли.
Выделение гноя из уретры.
Кровь, иногда с затруднением дыхания.
Моча внезапно прекращается и некоторое время не начинает снова течь.
Резкие боли в уретре при мочеиспускании.
Чувство жжения и прострелы в уретре, особенно после мочеиспускания.

Мужские половые органы.
Отек яичек (после ушибов).
Режущая боль от мошонки до корня полового члена.
Похотливость.
Импотенция, недостаточная эрекция и отсутствие эрекции.
Нехватка энергии при соитии.
Эрекция несовершенная и слишком непродолжительная.
Легкое семяизвержение даже без твердой эрекции.
Уныние после полового акта.
Неумеренные загрязнения.
Поток простатической жидкости во время опорожнения и после любых психических эмоций.
При слабости половых органов, сильном половом возбуждении, любовных мыслях, даже поллюции, вызванной простым присутствием женщины.

Женские половые органы.
Спазмы в матке с защемлением или сокращением, или с копанием над вульвой, сопровождающиеся напряжением в животе и прострелами, распространяющимися в левую часть грудной клетки.
Зуд в наружных и внутренних половых органах.
Стрельба во влагалище с ощущением, будто его надавливают.
Стрельба в половые губы.
Катамения преждевременная и слишком слабая.
Подавление менструаций.
Перед менструацией боли в груди, тревожные сны, сухой жар, боль, как от усталости в конечностях, слезотечение, беспокойство и боли в печени.
Во время менструации ощущение тяги и волочения в бедре или болезненные спазмы в животе.
Подавление менструации (с бесплодием).
Жгучие, едкие, разъедающие и едкие бели, сопровождающиеся или предшествующие коликам.
Грудь дряблая.
Воспаление молочных желез со швами, скирром молочных желез после ушиба.
Скиррозное уплотнение молочных желез с зудом и стреляющими болями.

Органы дыхания.
Катар с лихорадкой, болью в горле и отсутствием аппетита.
Охриплость.
Сухость в небольшом ограниченном месте гортани и щекотание, вызывающее кашель.
Кашель, вызываемый щекотанием и царапанием в горле.
Сухой кашель, спровоцированный щекотанием, стеснением в груди и лихорадкой по вечерам.
Удушающий кашель с приливом жара к лицу.
Сухой судорожный кашель.
Кашель, похожий на коклюш, с кровянистой мокротой или сильными приступами ночью, вызванный зудом в груди и горле, или из небольшого сухого пятна в гортани, без мокроты ночью, и тяжелый, кровянистый, гнойный зловонная мокрота в течение дня.
Кашель обычно проявляется ночью или вечером.
Одышка при ходьбе, удушающие приступы, затрудненное дыхание по утрам, при пробуждении.
Кашель, вызванный глубоким вдохом, приемом кислоты или соли.
Слабый кашель, но без мокроты, он должен проглотить то, что откашливает.
Желтая гнойная мокрота с гнилостным запахом.
Кашель усиливается в положении лежа.
Во время кашля боли в голове или в животе с прострелами в левом боку, усиливающимися от движения.
Кашель при беременности.

Сундук.
Короткое дыхание при ходьбе и малейшем движении, часто с судорожным кашлем.
Кашель снимает напряжение в груди.
Затруднение дыхания даже по утрам при пробуждении.
Дыхание затрудненное и медленное, особенно вечером в постели.
Затруднение дыхания с болями в груди вечером в постели.
Приступы удушья, как если бы в горле была закупорка.
Стрельба в грудину или сбоку в грудную клетку.
Колющая боль с болью в верхней и левой части грудной клетки по направлению к центру груди.
Давление за грудиной и желание глубоко вздохнуть.
Сильные боли в груди с сильным кашлем.
Давит на грудь, грудину и область сердца.
Тянущая боль в груди.
Шок в груди.
Кариес грудины.

Сердце.
Сердцебиение, особенно после питья.
Частые сотрясения в области сердца.

Шея и спина.
Напряжение в задней части шеи.
Боль от ссадины в шейных позвонках.
Увеличение шеи.
Боли в пояснице при сгибании назад.
Боль и сжатие над бедрами.
Давящая, спазматическая и тянущая боль в спине.
Боль, как от растяжения, в левой части спины и шеи.

Верхние конечности.
Плечи болезненные, как будто на них ушибы и ссадины.
Влажные, шелушащиеся и жгучие боли в предплечьях.
Онемение рук, особенно ладоней.
Трещина в лучезапястном суставе.
Пот на ладонях.
Торпор пальцев рук.
Зуд в тыльной стороне пальцев.
Желтые пятна на пальцах рук и желтоватые ногти.
Панарис.

Нижние конечности.
Тянущие боли в бедрах.
Артритные боли в коленях, разрывающие и напряженные, усиливающиеся при начале ходьбы после того, как сядут, с ощущением, будто сухожилия слишком короткие (во время подавления менструального цикла).
Беспокойство и тяжесть в ногах.
Усталость в коленях.
Трещина в коленном суставе.
Болезненный отек ног и ступней.
Красные пятна на икрах ног, иногда болезненные, впоследствии становящиеся зелеными или желтыми, как после удара или ушиба, и затрудняющие движение стопы, которая отведена назад, как если бы сухожилия были сокращены.
Судороги в икрах голеней.
Холод и сильная предрасположенность к простуде в ступнях (даже от небольшого оголения ступней).
Оцепенение и нечувствительность стоп.
Пустулы на стопах.

Общие сведения.
Спазмы и спазматические боли в разных частях тела.
Боль, как от усталости в конечностях и суставах в состоянии покоя.
Ночные боли и страдания, нарушающие сон.
Симптомы появляются во время покоя и усиливаются при начале ходьбы или при любом движении.
Склонность к растяжению нижней части спины.
Приступы истерии и ипохондрии.
Шок в сухожилиях, дрожь и судорожные толчки в конечностях.
Бурление крови.
Отеки.
Набухание и уплотнение желез с покалыванием и стреляющими болями.
Приступы обморока.
Сильное общее уныние с непроизвольным смехом.
Ощущение усталости, особенно рано утром в постели.
Беспокойство в теле, особенно в ногах.
Недостаток энергии и нервная слабость.
Расход.
Внезапное опускание во время ходьбы.
Сильная предрасположенность к простуде.
Сильная утомляемость и другие страдания от ходьбы на свежем воздухе.
Продолжительное лишение естественного жизненного тепла.

Скин.
Стрельба и покалывание, зуд в коже.
Опухание желез с покалыванием и швами после ушибов и ушибов.
Синеватый цвет кожи по всему телу.
Болезненное воспаление кожи.
Крапивница в результате сильных физических упражнений.
Прыщи, как при чесотке, переходящие в налет.
Коричневые или красные и зудящие пятна по всему телу, которые исчезают и возвращаются.
Влажные или паршивые и жгучие гнили.
Черноватые язвы с сукровичными, кровянистыми и зловонными выделениями и покалывающим напряжением.
Гангренозные язвы.
Изъязвление костей.
Панарис.
Петехии.
Красноватые и зеленоватые пятна, как от экхимоза.

Сон.
Сонливость днем, даже очень рано утром.
Сонливость.
Склонность спать по вечерам с опущением век.
Поздний сон.
Нарушенный и неосвежающий сон со слезотечением и частыми тревожными и пугающими сновидениями.
Сны о болезнях, увечьях, смерти, опасности и ссорах.
Ночью головная боль, тошнота, гастралгия, кровотечение из носа, боли в конечностях и т. Д.
Бодрствование после полуночи с сильной болью.
Кошмар.
Запуск конечностей во сне.

Лихорадка.
Дрожь, частое похолодание и дрожь.
Холод и зябкость утром и в полдень.
Зябкость с желанием тепла, особенно на солнце.
Внутренний и внешний жар с сильной нервозностью.
Сухой, внутренний жар.
Медленная лихорадка с полным отсутствием аппетита.
Воспалительная лихорадка с сильным жаром, обильным потоотделением, анорексией, диареей и рвотой.
Лихорадка с воспалением горла и кашлем.
Пульс нерегулярный, обычно медленный и полный, чередующийся с небольшими и частыми ударами.
Ночной пот, даже в начале сна.
Жар с обильным потоотделением.
Пот днем ​​и ночью, как только закрываешь глаза и ложишься спать.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *