Conium гомеопатия: Кониум-Плюс инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Konium-Plus Гранулы гомеопатические (35305)

HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) собирали из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с окружающим кислородом и 5% -ным уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с необходимым количеством клеток и оставляли для прикрепления в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 ³ клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS оценивали количественно после инкубации в течение 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации контролировали и обрабатывали (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блоттинг

клеток HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств и ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и снижение жизнеспособности других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке конием 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке конием 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ^– часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium, с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отделением клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе 450 мкг / мл Conium.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечный график свидетельствует о наличии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе.

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводили путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию некоторых белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt снизились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств и ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α представляет собой фактор или рецептор, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем уровне [29]. Наши результаты показали повышающую регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в его нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие лекарственного средства и ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств с ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдокогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо такое противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H ₂ DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) собирали из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с окружающим кислородом и 5% -ным уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с необходимым количеством клеток и оставляли для прикрепления в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 ³ клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS оценивали количественно после инкубации в течение 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации контролировали и обрабатывали (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блоттинг

клеток HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств и ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и снижение жизнеспособности других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке конием 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке конием 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ^– часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium, с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отделением клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе 450 мкг / мл Conium.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечный график свидетельствует о наличии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе.

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводили путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию некоторых белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt снизились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств и ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α представляет собой фактор или рецептор, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем уровне [29]. Наши результаты показали повышающую регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в его нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие лекарственного средства и ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств с ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдокогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо такое противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H ₂ DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) собирали из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с окружающим кислородом и 5% -ным уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с необходимым количеством клеток и оставляли для прикрепления в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 ³ клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS оценивали количественно после инкубации в течение 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации контролировали и обрабатывали (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блоттинг

клеток HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств и ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и снижение жизнеспособности других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке конием 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке конием 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ^– часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium, с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отделением клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе 450 мкг / мл Conium.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечный график свидетельствует о наличии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе.

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводили путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию некоторых белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt снизились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств и ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α представляет собой фактор или рецептор, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем уровне [29]. Наши результаты показали повышающую регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в его нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие лекарственного средства и ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств с ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдокогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо такое противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H ₂ DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) собирали из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с окружающим кислородом и 5% -ным уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с необходимым количеством клеток и оставляли для прикрепления в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 ³ клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS оценивали количественно после инкубации в течение 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации контролировали и обрабатывали (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блоттинг

клеток HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств и ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и снижение жизнеспособности других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке конием 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке конием 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ^– часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium, с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отделением клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе 450 мкг / мл Conium.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечный график свидетельствует о наличии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе.

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводили путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию некоторых белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt снизились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств и ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α представляет собой фактор или рецептор, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем уровне [29]. Наши результаты показали повышающую регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в его нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие лекарственного средства и ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств с ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдокогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо такое противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H ₂ DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) собирали из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с окружающим кислородом и 5% -ным уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с необходимым количеством клеток и оставляли для прикрепления в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 ³ клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS оценивали количественно после инкубации в течение 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации контролировали и обрабатывали (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блоттинг

клеток HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств и ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и снижение жизнеспособности других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке конием 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке конием 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ^– часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium, с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отделением клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе 450 мкг / мл Conium.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечный график свидетельствует о наличии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе.

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводили путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию некоторых белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt снизились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств и ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α представляет собой фактор или рецептор, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем уровне [29]. Наши результаты показали повышающую регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в его нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Conium maculatum — Национальный центр гомеопатии

Естественная история.
Conium maculatum.
Ядовитая тсуга. N.O. Umbelliferæ.
Настойка свежего цветочного растения.

Клиническая.
Asthma.
Воспаление мочевого пузыря.
Поражение груди болезненное.
Бронхит.
Синяки.
Рак.
Катаракта.
Хорея.
Кашель.
Депрессия духов.
Дифтерийный паралич.
Дисмения (перепончатая).
Рожа.
Глаза, болезни.
Галакторея.
Герпес.
Ипохондрия.
Желтуха.
Печень увеличена.
Меланхолия.
Менструация нарушенная.
Онемение.
Поражение яичников.
Паралич Лэндри.
Перитонит.
Phthisis.
Беременность, болезненность груди во время.
Простатит.
Ptoses.
Золотуха.
Сперматорея.
Бесплодие.
Поражение желудка.
Поражения яичек.
Теттеры.
Тризм.
Опухоль.
Язвы.
Vertigo.
Зрение нарушенное.
Венс.

Характеристики.
Согласно Hahnemann Con. является одним из тех лекарств, у которых чрезвычайно трудно различить первичные и вторичные эффекты.
Тем не менее он думает, что первичным действием является «жесткость, уплотнение и сжатие волокон с набуханием желез и ослаблением чувств.«В этом Тесте соглашается, добавляя, что действие в первую очередь воспалительное, и это объясняет его пригодность для« людей с живым, быстрым, жизнерадостным нравом, с заметным развитием железистой системы », и объясняет, почему оно характерно адаптировано. к болезненным поражениям желез, «главным образом в результате напряжения или удара, но точная причина которых, возможно, ускользнула от наших воспоминаний». Teste ставит Con. во главе аналогов Acon. Это для желез и капиллярной системы какой Acon.для сердца и артериальной системы.
Во многих случаях Con. можно рассматривать как «Аконит хронических заболеваний». Другими аналогами аконита, по словам автора, являются Cham., Seneg., Canth. И Ph-ac. Против. соответствует хроническому или подострому воспалению с кровянистым нагрубанием паренхимы, уплотнением и даже последующим изъязвлением тканей.
Туя представляет собой медленную и прогрессирующую гипертрофию определенных тканей, определенных составляющих наших органов.
Стерк использовал Conium в своей героической манере и сделал с ним несколько заметных лекарств от скиррозных опухолей, изъязвлений и других заболеваний, но именно Ганеман первым показал, как это лекарство можно использовать как безопасно, так и эффективно.
Guernsey пишет: «Это лекарство характеризуется сильным головокружением, возникающим, когда он ложится, и очень слегка двигает головой или даже глазами — все содержимое комнаты, кажется, кружится, пациент хочет сохранить голову.
При мочеиспускании вода сначала течет полной струей, затем останавливается, снова течет, снова останавливается и т. д.
Нэш иллюстрирует модальность: ухудшение при движении головой.
Он думает, что «поворот головы набок» — наиболее характерная его форма.
Некоторые считают, что это «лечь в кровать и перевернуться», но он считает «лежание» наименее важной частью.
Он вылечил пациента, у которого были все симптомы локомоторной атаксии и который не мог при ходьбе поворачивать голову вбок, не шатаясь и не падая.
Случай люмбаго был вылечен с помощью Con. Через шесть дней, после семи месяцев страданий, появляется этот симптом: не может переворачиваться в постели без головокружения.
Ухудшение при подъеме от упражнений.
Ощущение, как мяч надавливает на спину над левым бедром, боль, простреливающая в левую ногу, заканчивающаяся пятном, которое ощущается как будто уколот пучком горячих игл.
В разделе «Ощущения» Гернси дает следующее: «Изжога, например, у беременных, когда возникает сильная изжога, когда ложится спать ночью.
Приступы болезненного самочувствия.
Ощущение, будто обруч, повязка или что-то тесное. вокруг частей
Недостаток раздражительности тела, тело имеет очень слабую чувствительность.
Стремительное движение изнутри наружу, напряжение во внутренних и внешних частях, колющие боли в костях. «В костях». Еще один симптом — «желтые ногти». Proell (H. W., XXX. 541) упоминает об использовании Con. который иллюстрирует симптом: «Прерывистый поток». У него были отличные результаты с Con. 10 при странгурии и задержке мочи, когда не удается отвести мочу, из-за нервозности или отека простаты. (Nat-s. 5 trit. Был эффективен там, где нельзя было полностью опорожнить мочевой пузырь.) Con. Оказывает очень выраженное действие на органы малого таза.
Запор очень выражен, или может быть диарея.
Обморок после стула.
Жжение или холод в прямой кишке.
Сиркар записал (Calcutta j. Of Med., Май 1896 г.) поразительный случай, иллюстрирующий последнее.
У пациента был сильный понос, из-за которого врач собирался дать Sulph., Когда он спросил, горячий ли стул.
«Напротив, они холодные», — ответила больная.
Сиркар обнаружил «холодный метеоризм» при Con., и дал это по аналогии с блестящим эффектом.
О сексуальной сфере Con. Обладает глубоким действием, часто встречается с довольно противоречивыми состояниями — гипертрофией или атрофией желез, нарушением функции или прекращением действия.
«Неудовлетворенное половое влечение» является очень важным признаком, и связанные с этим страдания у обоих полов эффективно смягчаются Кон. Я очень хорошо использовал это лекарство в бесчисленных случаях слабости от мастурбации у мужчин и молодежи.
«Излучение при малейшем раздражении, например, просто пребывании в обществе женщины» очень типично.
Многим «помолвленным» молодым людям лекарство помогло.
Это больше соответствует скудным менструациям, чем наоборот.
Гудно (Hoyne’s Theurapeutics-Amer. Hom., XXI. 386) вылечил 25-летнюю девушку от тяжелой дисмении (которая существовала с начала менструации) с скудным, почти остановленным течением.
У нее также было носовое кровотечение, кашель и временами колющие боли в левом легком.
Двумя годами ранее, после необычного возбуждения, у нее были тянущие боли, пролапс и антеверсия.
Боли при дисмении уменьшились с помощью Sepia и других средств, но пролапс усилился с надавливанием, как если бы матка была вытеснена из вульвы, ухудшение при стоянии и ходьбе перед и во время менструации, прерывистое мочеиспускание, рези после мочеиспускания, упорство длительный запор, стул (один раз в семь дней) обильный, твердый, за которым следует трепетная слабость, она должна лечь, тупая боль под левой молочной железой.
Быстрое облегчение и быстрое излечение были произведены Con. 1М.Показанием является скудная менструация (особенно у старых дев).
Проверенные лохии.
Боль в груди перед менструацией, усиливающаяся на каждом шагу, является убедительным показанием для Con. Также все последствия травм груди в результате падений или ударов.
После удара в грудь курсом Кон. всегда следует отдавать.
Нэш упоминает еще одну характеристику Con: «Потеет днем ​​или ночью, как только человек засыпает или даже при закрытии глаз». Это позволило Липпе вылечить 80-летнего мужчину от гемиплегии.
Р. К. Маркхэм вылечил с помощью Con. 1М. упорный кашель, сухой, жесткий, частый, с астматическим хрипом или тонким хрипом в груди при глубоком дыхании, ухудшение от малейшего воздействия холодного воздуха, попадания в холодную постель или из теплой постели или даже вытягивания рук было достаточно для при сильном кашле.
Ведущий симптом, появившийся последним и приведший к лекарству, был следующим: «Боль в верхушке левого легкого с болезненностью в небольшом пятне, на полпути между шеей и плечом, сразу за ключицей.
Боль, режущая и колющая, бежала вниз и внутрь к грудины.
А. Х. Бердсолл сообщает о случае ушиба яичка.
Он обнаружил, что пациент корчится в агонии, боль жаловалась на то, что она «острая, режущая, поднимается вверх по семенному канатику к нижней части спины, а также через мошонку к корню полового члена. К концу двадцати минут боль исчезла (HP, ix. 190.) Conium, соответствует: светловолосым людям, пожилым людям, старым, немощным мужчинам, старым девицам и холостякам, женщинам с жесткими волокнами и легко возбуждаемым женщинам, а также люди с противоположным темпераментом, люди с сильным, сидячим образом жизни, больше, чем живые, стройные люди и дети, люди, которые легко отравляются стимуляторами, женщины со скудными менструациями, скрофулезной конституцией, раком и увеличенными железами.
Последствия ударов или падений, последствия горя, чрезмерной учебы.
Пациенты, которым хуже в простое.
Говорят, что Conium был и почти наверняка был тем ядом, которым был казнен Сократа, и был ли это случай восходящего паралича, который произошел при его отравлении, является показанием для Conium. Ощущение онемения, неспособность поддерживать умственное усилие, слабая память, ощущение усталости в мозгу, слабоумие.
Горячие точки на голове.
Рожа, пронизывающая боль в мозг.
Красное зрение.
Слабость, дрожь и сердцебиение после каждого опорожнения.
Ощущение нереальности происходящего, как во сне.
Безумие, периодическое или попеременное.
Головокружение, усиливающееся при повороте в постели.
Накопление ушной серы.
Тяга к соли, кофе и кислому.
Наблюдается та же склонность к метеоризму, что и у его родственников Ammoniac и Asafetida.
Онемение и омертвение конечностей.
Колющие боли — отличное показание для Conium.Слабые приступы, обморок, внезапная потеря силы при ходьбе.
Пароксизмы истерии и ипохондрии от воздержания от полового акта.
Пациенты с туберкулезом не могут откашливаться, должны глотать мокроту.
Глазные симптомы очень выражены: светобоязнь, птоз и т. Д.
Эти симптомы усиливаются ночью и рано утром.
Большинство симптомов проявляются в состоянии покоя, особенно ночью и при периодических приступах, некоторые при ходьбе на свежем воздухе.
Ухудшение во время еды, в положении стоя, в положении лежа (кашель), в состоянии покоя, при поднятии пораженной части тела, при повороте в постели (головокружение), при очень малом движении головой, при повороте головы в стороны.
Улучшение в темноте, когда пораженная конечность свисает, от движения, при ходьбе, при наклоне.
Отвращение к свежему воздуху.
Желание тепла, особенно солнца.
Обязанность простудиться от малейшего воздействия на ноги.
Сильная предрасположенность к простуде.
Ночной и утренний пот с неприятным запахом и жжением в коже или неприятным запахом без пота.
Ухудшение прикосновения, не переносит давления тесной одежды.
Ясновидение, шок или хуже от падения.

Отношения.
Conium следует сравнить с Aethusa, Oena, Phel., Petros., Ammoniac., Asaf. И другими Umbelliferæ.
Противоядие от него получают: Coff., Dulc., Nit-ac. И Nit-s-d.
Противоядия: Merc., Nit-ac., Sulph.
Совместимость: Arn., Ars., Bell., Calc., Lyc., Nux-v., Phos., Puls., Rhus, Stram.
Несовместимо: я иногда обнаруживал Con. не согласны с пациентами, которые принимали Псор.
Сравните: при отеке и болезненности груди до и во время менструации Calc. (Con. Предшествует Calc. И хорошо следует за Calc. У субъектов с скудными менструациями, Bell. Соответствует Cal. В других отношениях), при скудных менструациях, Graph., При подавлении лохий, Nux-v., Hyos., Puls. , Sec., Как во сне, Ambra, Anac., Calc., Can-i., Stram., Восходящий паралич, Hydr-ac., Mang. (нисходящий, Merc.), паралич, постдифтеритический, Gels., сексуальная меланхолия, Zinc-ox., головокружение при повороте в постели, Sil. (Sil. Испытывает головокружение при повороте налево в положении лежа), хуже от начала движения, лучше от продолжительного движения, Rhus, ушиб желез, Sul-ac. Импотенция, Phos., Слабость после дефекации, Phos. (наиболее отмечен), Nux-v.

Причинная связь.
Ушибы.
Дует.
Горе.
Сексуальный избыток.
Половое воздержание.
Волнение.
Чрезмерная работа.
Снежный воздух.
Весна.

Mind.
Истерические страдания с грустью и сильной склонностью к слезам из-за подавления или из-за слишком свободного снисхождения полового влечения.
Антропофобия и все же страх одиночества.
Робость характера (боязнь грабителей).
Суеверные идеи.
Настроение бояться.
Дурное настроение и угрюмость.
Ипохондрическое безразличие.
Нехватка умственной энергии.
Неспособность к труду.
Раздражительность и склонность к гневу.
Безумие и мания.
Путаница мыслей, как от сонливости.
Замедление зачатия.
Слабость интеллектуальных способностей и памяти.
Готовая забывчивость, чрезмерное затруднение вспоминания вещей.
Бред.

Зав.
Отравление после употребления минимального количества спиртного, даже вина и воды в небольших количествах отравляет его.
Головокружение при повороте в постели; ощущение, будто кровать плывет.
Вихревое головокружение при вставании, а иногда и при падении, вбок, при взгляде назад (при осмотре) или при лежании в постели, особенно по утрам.
Приступы головной боли с тошнотой и рвотой слизью.
Стреляющая боль, особенно в макушке.
Отупляющие боли в голове, особенно при ходьбе на свежем воздухе, сначала в передней части головы, затем в задней части, с насморком, облегчающимся при наклоне и движении головой.
Чрезмерная чувствительность мозга даже к разговору и любому другому шуму.
Quotidian головная боль из-за недостаточной эвакуации.
Полу-боковые боли в голове, как от ушиба.
Рвущая боль в висках и по бокам головы с ощущением, будто мозг засыпает, хуже от контакта, движения и после еды, лучше в положении лежа или при наклоне.
Головная боль, как если бы голова была разбита на куски или могла быть раздавлена.
Давление вниз, как от камня на верхней части лобной кости.
Колющая боль в голове при кашле.
Ощущение, будто в голове большой посторонний предмет.
Тяжесть и ощущение полноты в голове, особенно при пробуждении утром.
Тянущая боль в голове с онемением мозга.
Гидроцефалия: боли усиливаются при пробуждении после еды, на свежем воздухе, лучше от внешнего давления, в положении лежа и при закрытии глаз.
Приступ рвущейся головной боли, заставляющей пациента лечь.
Упорные стреляющие боли в голени, которые, кажется, проходят через лоб.
Горячий прилив в затылке, затем в голове.
Тяжесть и сжимающая боль, словно когтем, во лбу, будто исходящая из желудка.
Апоплексия с параличом (у пожилых людей).
Выпадение волос.

Глаза.
Боль в глазах при чтении.
Зуд под глазами с жгучей и острой болью при их растирании.
Зуд, стреляющая или жгучая боль во внутреннем уголке глаз.
Ощущение холода или жжения в глазах при ходьбе на свежем воздухе.
Боль, словно жжение в глазах, с ноющей болью в глазницах по вечерам.
Воспаление и покраснение склеротической ткани.
Гордеолум.
(Пятна на роговице.)
Катаракта от ушиба.
Близорукость.
Желтый цвет склеротики.
Глаза тусклые.
Глаза выпуклые.
Трепетный взгляд.
Затмение зрения.
Мгновенная слепота днем ​​при ярком солнце.
Близорукость.
Пресбиопия.
Diplopia.
Во время чтения строки движутся.
Черные пятна и цветные полосы перед взглядом, в комнате.
Красный внешний вид предметов.
Ослепление при дневном свете.
Отвращение к свету без воспаления глаз.
Светобоязнь с бледно-красным цветом глазного яблока.

Уши.
Слезы и стреляющие боли в ушах и вокруг ушей, особенно при ходьбе на свежем воздухе.
Скопление серы, напоминающей заплесневелую бумагу, смешанную с гнойной слизью.
Сера кровавого цвета.
Рев и гудение в обоих ушах.
Жужжание, звон и урчание в ушах.
Болезненная чувствительность слуха.
Ухудшение слуха, прекращающееся после удаления серы и до тех пор, пока она не восстановится.
Набухание и уплотнение околоушных желез.

Нос.
Отек ноздрей.
В течение нескольких дней кончик носа толстый, красный, горячий, болезненный, хуже с левой стороны, позже с левой стороны губы появился желтый пузырь, полный гноя.
Гнойные выделения из носа.
Носовое кровотечение, частое при чихании.
Повышенная острота обоняния.
Слишком частое чихание.
Мучительное ощущение сухости в носу.
Упорная заложенность ноздрей.
Заложенность носа по утрам.

Лицо.
Жар в лицо.
Цвет лица болезненный, бледный и синеватый, иногда даже с отеком лица.
Трещины на коже лица с болью, как от экскориации после мытья и протирания.
Ночные боли в лице, рвущие и стреляющие.
Зуд, высыпания, язвы и грызуны на лице.
Влажный и распространяющийся герпес на лице.
Высыпания прыщей на лбу.
Сухость и шелушение губ.
Волдыри и язвы на губах.
Раковая язва на губе (от давления трубы).
Спастическое сжатие челюстей.
Шлифовка зубов.

Зуб.
Одонталгия, обычно тянущая, вызванная прогулкой на свежем воздухе или вызываемая в полых зубах холодной пищей.
Стрельба, рывки, грызение и прокалывание зубов.
Десны опухшие, кровоточащие и кровоточащие.

Устье.
Сухость во рту и горле или слюноотделение.
Смущенная речь.
Язык жесткий, болезненный, опухший, сухой, покрытый грязной слизью.
Ужасно зловонный язык.
(Рак языка).

Горло.
Боль в горле, как от клубка (globus hystericus), поднимающегося из эпигастрия.
Затруднение глотания.
Непроизвольное глотание, особенно при ходьбе на ветру.
Постоянное желание сглотнуть при ходьбе против ветра.
Спазмы в пищеводе.
Царапание в горле.
Спастическое сужение горла.

Аппетит.
Горечь во рту и в горле.
Гнилостный или кислый привкус во рту.
Полное отсутствие аппетита и сильная слабость пищеварения.
Хлеб не портится и не радует вкусом.
Булимы.
Желание кофе, кислой или соленой пищи.
Во время еды, особенно после приема молочной пищи, ощущение вздутия в желудке и животе и быстрое насыщение.
После еды кислый вкус, изжога, давление и переполнение желудка, подъемы, колики, метеоризм, тошнота, мертвенность в пальцах, слабость, утомляемость и пот.

Желудок.
Подъемы пустые, частые и шумные, иногда в течение всего дня.
Неудачные вставания с ощущением полноты в полости горла.
Рис, со вкусом еды.
Подавление отрыжки с последующей болью в желудке.
Изжог, поднимающийся вверх в горло, иногда после еды.
Кислотная отрыжка, особенно после еды.
Тошнота со склонностью к рвоте и полной потерей аппетита или же с отрыжкой и усталостью.
Тошнота после каждого приема пищи или вечером.
Тошнота и рвота при беременности.
Рвота слизью.
Давление в желудке даже во время еды.
Вздутие желудка.
Спазматическая схваткообразная боль, прострелы и боли, как от экскориации, в желудке и эпигастрии.
Ощущение болезненности и саднения в желудке и животе при ходьбе по камням.
Боль с ощущением холода в желудке.

Живот.
После приема молока ощущение вздутия живота.
Тяжелая боль в подреберье, словно от туго затянутой повязки.
Твердость живота от набухания брыжеечных желез.
Давление, тяга, разрывы и прострелы в области печени.
Ланцинация в левом подреберье, даже утром в постели, со стеснением.
Проколы в животе, как будто в него воткнули нож, колющие боли в селезенке.
Полнота живота даже по утрам при пробуждении.
Набухание брыжеечных желез.
Сокращение живота со стеснением.
Спастическая колика.
Резкие и рвущие боли в животе.
Передвижение и копание в пупочной области.
Ощущение экскориации в животе, особенно при ходьбе по тротуару.
Шум и урчание в животе.
Изгнание холодного ветра с черенками.
Задержание газов.
Черенки при отхождении газов.

Стул и анус.
Запор с тенезмами.
Постоянные позывы без стула.
Тяжелая эвакуация, только раз в два дня.
Твердый стул с тенезмами (головная боль, отхождение простатической жидкости).
Сыпучие непереваренные отходы с черенками и частыми подъемами.
Ослабляющий понос.
(непереваренный стул с коликами).
Проколы в заднем проходе.
Жар и ощущение жжения в прямой кишке при опорожнении и в другое время.
Зловонный или холодный метеоризм (ощущение холода в стуле).
Кал с прожилками крови.
После опорожнения кишечника слабость, учащенное сердцебиение, частое изгнание газов и дрожь.
Непроизвольное отхождение кала во время сна.

Мочевыводящие органы.
Давление на мочевой пузырь, как будто моча будет выделять насилие (с колющими швами), хуже при ходьбе, лучше при сидении.
Ночью частое, а иногда и непроизвольное мочеиспускание.
Вытекание мочи, сопровождающееся сильной болью.
Моча густая, белая и мутная.
Моча красная.
Задержка мочи.
Затрудненное отхождение мочи, которая течет только по каплям.
Ночное мочеиспускание.
Смачивание постели.
Диабет, сопровождающийся сильной болью.
Частое желание выделять мочу прозрачную и водянистую.
Вязкая слизь, смешанная с мочой, которая не может пройти без сильной боли.
Выделение гноя из уретры.
Кровь, иногда с затруднением дыхания.
Моча внезапно прекращается и некоторое время не начинает снова течь.
Резкие боли в уретре при мочеиспускании.
Чувство жжения и прострелы в уретре, особенно после мочеиспускания.

Мужские половые органы.
Отек яичек (после ушибов).
Режущая боль от мошонки до корня полового члена.
Похотливость.
Импотенция, недостаточная эрекция и отсутствие эрекции.
Нехватка энергии при соитии.
Эрекция несовершенная и слишком непродолжительная.
Легкое семяизвержение даже без твердой эрекции.
Уныние после полового акта.
Неумеренные загрязнения.
Поток простатической жидкости во время опорожнения и после любых психических эмоций.
При слабости половых органов, сильном половом возбуждении, любовных мыслях, даже поллюции, вызванной простым присутствием женщины.

Женские половые органы.
Спазмы в матке с защемлением или сокращением, или с копанием над вульвой, сопровождающиеся напряжением в животе и прострелами, распространяющимися в левую часть грудной клетки.
Зуд в наружных и внутренних половых органах.
Стрельба во влагалище с ощущением, будто его надавливают.
Стрельба в половые губы.
Катамения преждевременная и слишком слабая.
Подавление менструаций.
Перед менструацией боли в груди, тревожные сны, сухой жар, боль, как от усталости в конечностях, слезотечение, беспокойство и боли в печени.
Во время менструации ощущение тяги и волочения в бедре или болезненные спазмы в животе.
Подавление менструации (с бесплодием).
Жгучие, едкие, разъедающие и едкие бели, сопровождающиеся или предшествующие коликам.
Грудь дряблая.
Воспаление молочных желез со швами, скирром молочных желез после ушиба.
Скиррозное уплотнение молочных желез с зудом и стреляющими болями.

Органы дыхания.
Катар с лихорадкой, болью в горле и отсутствием аппетита.
Охриплость.
Сухость в небольшом ограниченном месте гортани и щекотание, вызывающее кашель.
Кашель, вызываемый щекотанием и царапанием в горле.
Сухой кашель, спровоцированный щекотанием, стеснением в груди и лихорадкой по вечерам.
Удушающий кашель с приливом жара к лицу.
Сухой судорожный кашель.
Кашель, похожий на коклюш, с кровянистой мокротой или сильными приступами ночью, вызванный зудом в груди и горле, или из небольшого сухого пятна в гортани, без мокроты ночью, и тяжелый, кровянистый, гнойный зловонная мокрота в течение дня.
Кашель обычно проявляется ночью или вечером.
Одышка при ходьбе, удушающие приступы, затрудненное дыхание по утрам, при пробуждении.
Кашель, вызванный глубоким вдохом, приемом кислоты или соли.
Слабый кашель, но без мокроты, он должен проглотить то, что откашливает.
Желтая гнойная мокрота с гнилостным запахом.
Кашель усиливается в положении лежа.
Во время кашля боли в голове или в животе с прострелами в левом боку, усиливающимися от движения.
Кашель при беременности.

Сундук.
Короткое дыхание при ходьбе и малейшем движении, часто с судорожным кашлем.
Кашель снимает напряжение в груди.
Затруднение дыхания даже по утрам при пробуждении.
Дыхание затрудненное и медленное, особенно вечером в постели.
Затруднение дыхания с болями в груди вечером в постели.
Приступы удушья, как если бы в горле была закупорка.
Стрельба в грудину или сбоку в грудную клетку.
Колющая боль с болью в верхней и левой части грудной клетки по направлению к центру груди.
Давление за грудиной и желание глубоко вздохнуть.
Сильные боли в груди с сильным кашлем.
Давит на грудь, грудину и область сердца.
Тянущая боль в груди.
Шок в груди.
Кариес грудины.

Сердце.
Сердцебиение, особенно после питья.
Частые сотрясения в области сердца.

Шея и спина.
Напряжение в задней части шеи.
Боль от ссадины в шейных позвонках.
Увеличение шеи.
Боли в пояснице при сгибании назад.
Боль и сжатие над бедрами.
Давящая, спазматическая и тянущая боль в спине.
Боль, как от растяжения, в левой части спины и шеи.

Верхние конечности.
Плечи болезненные, как будто на них ушибы и ссадины.
Влажные, шелушащиеся и жгучие боли в предплечьях.
Онемение рук, особенно ладоней.
Трещина в лучезапястном суставе.
Пот на ладонях.
Торпор пальцев рук.
Зуд в тыльной стороне пальцев.
Желтые пятна на пальцах рук и желтоватые ногти.
Панарис.

Нижние конечности.
Тянущие боли в бедрах.
Артритные боли в коленях, разрывающие и напряженные, усиливающиеся при начале ходьбы после того, как сядут, с ощущением, будто сухожилия слишком короткие (во время подавления менструального цикла).
Беспокойство и тяжесть в ногах.
Усталость в коленях.
Трещина в коленном суставе.
Болезненный отек ног и ступней.
Красные пятна на икрах ног, иногда болезненные, впоследствии становящиеся зелеными или желтыми, как после удара или ушиба, и затрудняющие движение стопы, которая отведена назад, как если бы сухожилия были сокращены.
Судороги в икрах голеней.
Холод и сильная предрасположенность к простуде в ступнях (даже от небольшого оголения ступней).
Оцепенение и нечувствительность стоп.
Пустулы на стопах.

Общие сведения.
Спазмы и спазматические боли в разных частях тела.
Боль, как от усталости в конечностях и суставах в состоянии покоя.
Ночные боли и страдания, нарушающие сон.
Симптомы появляются во время покоя и усиливаются при начале ходьбы или при любом движении.
Склонность к растяжению нижней части спины.
Приступы истерии и ипохондрии.
Шок в сухожилиях, дрожь и судорожные толчки в конечностях.
Бурление крови.
Отеки.
Набухание и уплотнение желез с покалыванием и стреляющими болями.
Приступы обморока.
Сильное общее уныние с непроизвольным смехом.
Ощущение усталости, особенно рано утром в постели.
Беспокойство в теле, особенно в ногах.
Недостаток энергии и нервная слабость.
Расход.
Внезапное опускание во время ходьбы.
Сильная предрасположенность к простуде.
Сильная утомляемость и другие страдания от ходьбы на свежем воздухе.
Продолжительное лишение естественного жизненного тепла.

Скин.
Стрельба и покалывание, зуд в коже.
Опухание желез с покалыванием и швами после ушибов и ушибов.
Синеватый цвет кожи по всему телу.
Болезненное воспаление кожи.
Крапивница в результате сильных физических упражнений.
Прыщи, как при чесотке, переходящие в налет.
Коричневые или красные и зудящие пятна по всему телу, которые исчезают и возвращаются.
Влажные или паршивые и жгучие гнили.
Черноватые язвы с сукровичными, кровянистыми и зловонными выделениями и покалывающим напряжением.
Гангренозные язвы.
Изъязвление костей.
Панарис.
Петехии.
Красноватые и зеленоватые пятна, как от экхимоза.

Сон.
Сонливость днем, даже очень рано утром.
Сонливость.
Склонность спать по вечерам с опущением век.
Поздний сон.
Нарушенный и неосвежающий сон со слезотечением и частыми тревожными и пугающими сновидениями.
Сны о болезнях, увечьях, смерти, опасности и ссорах.
Ночью головная боль, тошнота, гастралгия, кровотечение из носа, боли в конечностях и т. Д.
Бодрствование после полуночи с сильной болью.
Кошмар.
Запуск конечностей во сне.

Лихорадка.
Дрожь, частое похолодание и дрожь.
Холод и зябкость утром и в полдень.
Зябкость с желанием тепла, особенно на солнце.
Внутренний и внешний жар с сильной нервозностью.
Сухой, внутренний жар.
Медленная лихорадка с полным отсутствием аппетита.
Воспалительная лихорадка с сильным жаром, обильным потоотделением, анорексией, диареей и рвотой.
Лихорадка с воспалением горла и кашлем.
Пульс нерегулярный, обычно медленный и полный, чередующийся с небольшими и частыми ударами.
Ночной пот, даже в начале сна.
Жар с обильным потоотделением.
Пот днем ​​и ночью, как только закрываешь глаза и ложишься спать.