Звездочка где мазать при простуде: Как я использую бальзам «Золотая звезда» при простуде | Типичная домохозяйка

Содержание

Звездочка | Бренды

История «Золотой Звезды», или как её привыкли ласково называть в нашей стране «Звездочки», началась в середине XX века. Именно тогда во Вьетнаме, в стране, которой считается её Родиной, начались продажи бальзамов со схожей фармакологической комбинацией.

Однако оригинальный состав, который включает смесь эфирных масел коричника китайского, мяты перечной, эвкалипта, гвоздики с левоментолом и камфорой, был впервые зарегистрирован как лекарственное средство в конце 60-х годов.

Немного позднее, через 10 лет, в виду тесного сотрудничества Вьетнама и Совесткого Союза, Звездочка попала на территорию нашей страны, вместе с другими товарами, произведёнными дружественным государством. С 70-х годов ХХ века началась история бренда «Золотая Звезда» в России и странах бывшего СНГ. Легендарный бальзам начал поставляться в советский аптеки. С тех пор эта мазь с характерным ментолово-эвкалиптовым запахом быстро завоевала популярность. Звездочкой лечили ОРВИ, грипп, ринит, облегчали симптомы головной боли, применяя бальзам точечно у висков.

А дети запомнили мазь с золотой звездочкой на маленькой красной баночке как незаменимое средство от комариных укусов. Каждая заботливая мама при малейших признаках простуды у ребёнка мазала бальзамом крылья носа.

После развала СССР централизованные поставки Звездочки прекратились. Но за обеспечение России и стран СНГ любимым бальзамом взялась компания ДОМИНАНТА-СЕРВИС. В 1998 году бальзам «Золотая Звезда» был зарегистрирован как лекарственное средство, а ещё через пару лет появились 2 новые формы – жидкий бальзам и карандаш для ингаляций.

Сегодня Звездочка – это большая линейка противопростудных лекарственных препаратов, которая включает не только полюбившиеся многим бальзамы, но и порошки для снижения температуры, назальные спрей и капли для снятия заложенности носа, противокашлевые сиропы для улучшения отхождения мокроты, таблетки для рассасывания при боли в горле. Ассортимент незаменимых в борьбе с симптомами ОРВИ и гриппа лекарственных средств продолжает традиции Золотой Звезды.

А объединяют все продукты доступная цена и неизменимое высокое качество. Продукты под брендом «Звездочка» — средства, проверенные временем.

где мазать и как применять?

Еще с советских времен людям хорошо известна звездочка от сильного кашля. Данный бальзам является универсальным средством и лечит как насморк, так и бронхиты, и даже пневмонию.

Для многих этот бальзам известен еще с детства. Наши мамы и бабушки сразу брали «Звездочку», если у ребенка начинался кашель и первые признаки простуды. Ее до сих пор можно найти во многих аптечках. Даже сейчас мазь совершенно не потеряла популярности, и если вы тоже хотите быстро прийти в форму и избавиться от кашля, то имеет смысл купить ее. Кроме того, она стоит действительно копейки даже в настоящее время.

Бальзам создан во Вьетнаме, с учетом базовых правил восточной медицины. Все компоненты в составе абсолютно натуральны, поэтому вряд ли он навредит даже детям. Чтобы убедиться, что перед вами подлинная «Звездочка», а не аналог в схожей упаковке, достаточно этот состав изучить.

Сюда входят:

  1. Эфирные масла (камфоровое, ментоловое, эвкалиптовое масла, а также гвоздики, корицы).
  2. Вазелин.
  3. Парафин.
  4. Пчелиный воск.
  5. Ментол в кристаллическом виде.

Читайте также: Рецепты с эвкалиптом от кашля

Если в составе нет других добавок, то перед покупателем действительно та самая звездочка от сильного кашля. Кстати, он справедлив только для бальзама.

Леденцы и гель для ингаляции несколько беднее компонентами, но все равно их будет достаточно, чтобы избавиться от болезней. Как ясно из информации выше, «Звездочка» выпускается в 4-х модификациях:

  • бальзам;
  • леденцы;
  • карандаш для ингаляции;
  • жидкость.

Конечно же, наибольшей популярностью пользуется первый вариант, который продается в круглой алюминиевой баночке. Субстанция имеет желтый цвет и характерный аромат, при попадании на кожу – тает.

Польза «Звездочки»

Прежде чем приступать к инструкции, неплохо было бы узнать, чем вообще полезен бальзам, так как кашель – это далеко не единственное, с чем он может справиться.

«Звездочку» рекомендуют:

  • для профилактики и лечения гриппа, ОРВИ, простуды;
  • при насморке, в том числе и гайморите;
  • для лечения и даже профилактики болезней суставов;
  • при растяжениях;
  • для устранения мигрени и головной боли;
  • устранения зубных болей;
  • для поднятия духа, профилактики усталости и депрессии;
  • против сухих мозолей;
  • против многих кожных болезней;
  • для снижения зуда при укусах насекомых – клопов, комаров.

Как видно, одна «Звездочка» в аптечке является универсальным средство, которое легко справиться со многими недугами и окажет первую помощь.

Кому бальзам противопоказан

В состав «Звездочки» входят весьма агрессивные, хоть и натуральные компоненты. Поэтому если вы задумываетесь, можно ли применять сегодня это средство для маленьких детей, то обязательно ознакомьтесь со списком противопоказаний. Сюда входят:

  • беременным женщинам категорически нельзя пользоваться «Звездочкой»;
  • женщинам, которые кормят грудью;
  • людям, у которых есть аллергия на ментол и другие компоненты;
  • детям до 3-х лет.

Более взрослому ребенку «Звездочку» брать можно и даже нужно. За счет натуральных компонентов это средство способно без мощных препаратов избавить всю семью от простуды. Только нужно помнить, что бальзам этот не вечен, хоть его срок хранения и довольно большой. Он составляет 4 года. Только нежелательно оставлять его на солнце или жаре, так как он имеет свойство таять от тепла.

Применение «Звездочки»

В целом возможности с этим бальзамом очень широки. Если вас мучает кашель, и вы ощущаете, что он идет из груди, то есть, имеют место болезни легких или бронхов, то хорошо натрите составом грудь и спину в данных областях. Избегать стоит только примерной области сердца. «Звездочки» берут не слишком много, но она должна впитаться, оставив легкий жирноватый блеск. Далее желательно сразу надеть теплую одежду или даже перевязаться пуховым платком и полежать под одеялом. Идеально проводить процедуру на ночь, перед сном.

Если болят суставы, крутит руки, ноги, спину, то инструкция тут точно такая же – мажете места, хорошо их укутываете, чтобы бальзам прогрел все участки. Только выбирайте ненужную одежду, потому что избавиться от запаха очень тяжело.

При насморке и кашле горловом «Звездочку» наносят под ноздри, в области гайморовых и лобных пазух, на горло и под челюсть. В целом бальзам втирают, пока кожа не покраснеет. Также наносят его и при зубной боле. Если болит голова, небольшое количество состава втирают в виски, в лоб, в затылок.

Читайте также: Эффективна ли ромашка от кашля у детей

Если у вас сухой кашель, простуда, насморк, то эффективными будут ингаляции. На 1 литр воды берут небольшую горошину состава. Ее разбавляют в горячей воде. Далее укройтесь плотным полотенцем или пледом, чтобы все пары не выходили наружу, и вы их вдыхали. Примерно 10 минут в день будет достаточно. Бальзам в обычном виде применяют не чаще 3-х раз в сутки, небольшими порциями.

Детям можно брать дозировку меньше. Леденцы рассасывают, их можно больше принимать за сутки. Они имеют приятный и любимый многими мятный, сладковатый вкус. Они не навредят даже в виде средства для профилактики, но слишком злоупотреблять не стоит – можно вызвать гастрит и общее раздражение организма от компонентов.

Бальзам «Звездочка» при простуде. Как его используют вьетнамцы? Учимся делать это правильно

Все методы лечения болезней можно условно поделить на медикаментозные и народные. В нашей стране второй метод распространен достаточно широко. Иногда у нас народной медицине верят гораздо больше, чем официальной. Это не значит, что не нужно ходить к врачам. Любое лечение в первую очередь нужно согласовывать именно со специалистом. Что касается народной медицины, то самостоятельное применение вьетнамского бальзама «Звёздочка», это как раз из этой серии. Хоть на этот препарат есть и официальная инструкция, часто его используем мы, что называется, на своё усмотрение. Наверное, поэтому не всегда получаем от него тот лечебный эффект на который первоначально рассчитываем. Между тем, вьетнамцы применяют «свою звёздочку» по-другому, в частности при простуде.

Именно этот вариант мы сейчас и рассмотрим более подробно.Как пользоваться бальзамом звездочка при простуде? Учимся у вьетнамцевВсе знают, что родиной этого бальзама является Вьетнам. А это значит, что именно вьетнамцы знают всё о его правильном применении. Мы же используем «Звездочку» несколько иначе. Откуда пошёл этот стереотип, сейчас уже трудно сказать. С этим мы разбираться не будем, а лучше выясним, какие мы совершаем ошибки, и как используют бальзам вьетнамцы.Применение бальзама «Звёздочка» в РоссииМы сейчас говорим только про обыкновенную простуду, кашель и насморк. Так вот, в этом случае у нас привыкли втирать «Звездочку» в область носовых пазух, а также ещё и между бровей. Мы считаем, что воздействуя именно на эти области, можно быстро «прогнать» простуду. Во Вьетнаме поступают по-другому.Читайте также: Как быстро вылечить простуду? 5 способов сделать это всего за одну ночьПрименение бальзама «Звёздочка» во ВьетнамеВьетнамцы объясняют, как нужно правильно пользоваться этим бальзамом, чтобы он действительно быстро помог при простуде.
Им нужно мазать не вокруг носа, а втирать его между пальцами на руках и на ногах. Делать это лучше всего на ночь, после чего, надеть тёплые перчатки и носки. В этом случае простуда обычно отступает через несколько дней.Читайте также: Термоядерный рецепт от простуды с коньяком! Вкусный и полезный согревающий напитокЖелаю всем здоровья, но, если к Вам подкралась простуда, попробуйте применить базам «Звездочка» по-вьетнамски, то есть – правильно.И смотрим видео про этот знаменитый бальзам. P.S. Расскажите своим друзьям где нужно мазать бальзамом «Звездочка» при простуде. Поделитесь, пожалуйста, с ними постом в социальных сетях. Буду Вам очень признателен за это. Понравилась статья? Поделись с друзьями!

Бальзам «Звездочка» при простуде. Как его используют вьетнамцы? Учимся делать это правильно

толстых и тонких мазков крови на малярию

Обзор обследования

Врачи используют толстый и тонкий мазки крови, чтобы определить, есть ли у вас малярия. Если один тест отрицательный и паразиты не обнаружены, вам будут делать повторные мазки крови каждые 8 ​​часов в течение нескольких дней, чтобы подтвердить отсутствие малярийной инфекции.

Мазки крови чаще всего берут из пальца. Толстые и тонкие мазки крови позволяют врачам узнать процент инфицированных эритроцитов (плотность паразитов) и тип присутствующих паразитов.

  • Мазок крови представляет собой каплю крови на предметном стекле. Толстые мазки крови наиболее полезны для обнаружения паразитов, поскольку они исследуют больший образец крови. (Часто на момент проведения анализа в крови обнаруживается несколько паразитов.)
  • Тонкий мазок крови — это капля крови, размазанная по большой площади предметного стекла. Тонкие мазки крови помогают врачам определить, какой вид малярии вызывает инфекцию.

Почему это делается

Микроскопическое исследование толстого и тонкого мазков крови является надежным и широко доступным тестом на малярию.

Результаты

Результаты толстого и тонкого мазка крови могут показать:

Обычный

В эритроцитах отсутствуют паразиты. Ваш врач будет повторять тест каждые 8 ​​часов в течение 1 или 2 дней, если он или она все еще подозревает, что у вас малярия.

Ненормальный

Паразиты присутствуют в эритроцитах. Идентифицирован заражающий вид Plasmodium . Также определяют процент эритроцитов, инфицированных паразитом Plasmodium (плотность).

Лечение может варьироваться в зависимости от:

  • Присутствуют виды Plasmodium . Малярия, вызванная P. falciparum , является более серьезной, чем другие типы, и ее можно лечить по-разному.
  • Процент инфицированных эритроцитов (плотность паразитов), а не количество паразитов. Если инфицирован большой процент клеток крови, лекарство можно вводить непосредственно в вену (внутривенно или внутривенно), а не через рот (перорально).

О чем думать

Мазки крови являются надежным тестом на малярию.Возможно, вы захотите спросить, планируется ли сделать толстый или тонкий мазок крови, или и то, и другое. Тонкий мазок крови определит вид малярийного паразита. Эта информация важна для предотвращения или прогнозирования опасных для жизни осложнений, если источником инфекции является P. falciparum .

Кредиты

Актуально на:
23 сентября 2020 г.

Автор: Healthwise Staff
Медицинский обзор:
E. Gregory Thompson MD — Терапия
Anne C.Пуанье, доктор медицины – внутренние болезни
Адам Хасни, доктор медицины – семейная медицина
В. Дэвид Колби IV MSc, MD, FRCPC – инфекционные заболевания

Актуально на: 23 сентября 2020 г.

Автор: Healthwise Staff

Медицинское обозрение: E. Грегори Томпсон, доктор медицинских наук, внутренняя медицина, и Энн К. Пуанье, доктор медицины, внутренняя медицина, и Адам Хасни, доктор медицины, семейная медицина, и В. Дэвид Колби, IV MSc, MD, FRCPC, инфекционные заболевания

.

Анализ мокроты на туберкулез (ТБ)

Что такое ТБ?

Туберкулез – это серьезное заболевание, вызываемое микробами (бактериями), которые распространяются по воздуху.Человек с активной формой ТБ в легких может передать заболевание ТБ другому человеку. Когда человек с активной формой туберкулеза кашляет, чихает, поет или разговаривает, он распространяет микробы туберкулеза по воздуху.

Туберкулез обычно поражает легкие, но может также поражать и другие части тела, такие как железы, кости, суставы, почки, головной мозг и репродуктивные органы.

Туберкулёз можно вылечить. В Британской Колумбии вы можете получить лекарства для профилактики или лечения туберкулеза. Лекарства предоставляются бесплатно через провинциальные противотуберкулезные службы и отделы общественного здравоохранения.

Для получения дополнительной информации о туберкулезе см. файл HealthLinkBC № 51a Туберкулез (ТБ).

Что такое мокрота?

Мокрота (или мокрота) представляет собой слизь, которую вы отхаркиваете из глубины легких. Обычно он густой, мутный и липкий. Мокрота – это не слюна (слюна), так как слюна выходит изо рта и является жидкой, прозрачной и водянистой. Не собирайте слюну для этого теста.

Зачем мне сдавать анализ мокроты на туберкулез?

Анализ мокроты на наличие бактерий туберкулеза — лучший способ узнать, есть ли у вас активная форма туберкулеза.

Если вы принимаете лекарство от туберкулеза, анализ мокроты — лучший способ узнать, действует ли лекарство.

Почему я должен сдавать 3 образца мокроты?

Очень важно, чтобы результаты анализа мокроты были точными. Сбор 3 образцов мокроты может повысить точность результатов анализа. Ваш поставщик медицинских услуг сообщит вам, можете ли вы собрать 3 образца мокроты в один и тот же день или вам следует собрать мокроту в разные дни. Следуйте инструкциям, которые дает вам ваш лечащий врач.

Как собрать мокроту?

Чтобы собрать мокроту, выполните следующие действия:

  1. Соберите мокроту рано утром, если только ваш лечащий врач не дал вам иных указаний
  2. Не ешьте, не пейте, не курите, не чистите зубы и не пользуйтесь жидкостью для полоскания рта до сбора мокроты
  3. Убедитесь, что ваше имя, фамилия и дата рождения указаны на этикетке флакона для сбора мокроты
  4. Соберите свою мокроту вдали от других людей. Если возможно, выйдите на улицу или откройте окно во время сбора мокроты
  5. Откройте бутыль с мокротой.Не прикасайтесь внутрь флакона для мокроты или внутрь крышки
  6. Сделайте глубокий вдох. Задержите воздух на несколько секунд. Медленно выдохните. Сделайте еще один глубокий вдох. Сильный кашель до появления мокроты изо рта
  7. Выплюньте мокроту во флакон для сбора мокроты. Делайте это до тех пор, пока не будет достаточно мокроты, чтобы покрыть дно флакона
  8. Плотно завинтите крышку флакона для сбора мокроты, чтобы он не вытекал
  9. Напишите дату и время сбора мокроты на этикетке флакона для сбора мокроты
  10. Запечатайте бутылку с мокротой в пластиковый пакет, в который она входит.Не кладите более 1 флакона для сбора мокроты в каждый пластиковый пакет
  11. Обязательно поместите бумажную лабораторную форму в мешочек снаружи пластикового пакета (не в бутылку с мокротой)
  12. После того, как вы закончите собирать мокроту, вымойте руки. Дополнительную информацию о правильном мытье рук см. в файле HealthLinkBC № 85. Мытье рук: помощь в остановке распространения микробов
  13. .

Что мне делать с флаконами для сбора мокроты?

Как можно скорее доставьте флаконы с мокротой в лабораторию или своему лечащему врачу. Храните флаконы с мокротой в холодильнике до тех пор, пока вы не сможете их принести. Не храните флаконы с мокротой при комнатной температуре и не замораживайте. Если вы не знаете, куда вернуть флаконы для сбора мокроты, спросите об этом своего поставщика медицинских услуг.

Какие анализы будут проведены с моей мокротой?

Будет проведено 2 анализа вашей мокроты:

Для мазка сотрудники лаборатории изучат часть вашей мокроты под микроскопом. Если они увидят бактерии в вашей мокроте, результат анализа мазка будет положительным.

Для посева сотрудники лаборатории помещают часть вашей мокроты в специальный контейнер для выращивания. Если бактерии растут, результат посева положительный.

Если результат анализа мазка или посева положительный, ваш лечащий врач обсудит с вами, что означает этот результат.

Когда я получу результаты анализов мокроты?

Результаты анализа мазка обычно готовы в течение 1–2 рабочих дней после поступления в лабораторию. Результаты посева могут занять до 8 недель, в зависимости от того, насколько быстро растут бактерии.

Лаборатория уведомит вашего лечащего врача о результатах анализов, как только они будут готовы. Если результаты вашего теста будут положительными, ваш лечащий врач сообщит вам об этом.

Убедитесь, что ваш поставщик медицинских услуг знает, как связаться с вами, чтобы сообщить результаты анализов. Обратитесь к своему поставщику медицинских услуг, чтобы убедиться, что у него есть ваш текущий номер телефона и адрес.

Если у вас есть какие-либо вопросы или опасения, обратитесь к своему лечащему врачу.

 

Скрининг рака шейки матки: новые данные о вариантах и ​​результатах

Онколог-гинеколог Меган Суонсон, доктор медицины, магистр здравоохранения, расшифровывает недавние изменения в рекомендациях по скринингу рака шейки матки и использует данные, чтобы пролить свет на относительную ценность вариантов тестов — мазок Папаниколау, обнаружение штаммов ВПЧ высокого риска или оба теста вместе. Она объясняет следующие шаги для пациентов с аномальными результатами, предоставляя визуальные алгоритмы для изображения путей к надлежащему лечению.

Я Меган. Один из пяти онкологов Джоанны в Калифорнийском университете в Сан-Франциско и рад быть здесь с вами сегодня, ребята, мы пройдем скрининг. На самом деле, что такое скрининг и почему рак шейки матки особенно подходит для скрининга, который является вторичной профилактикой. Мы поговорим о правилах проверки. Соединенные Штаты, в частности Целевая группа профилактических служб США и американское онкологическое общество.Руководство по CS расскажет о том, чем они похожи и чем отличаются. Мы немного поговорим о данных. Хм, я думаю, это пара лучших исследований, в которых сравнивались некоторые методы скрининга и разная чувствительность. Мы видим, что мы будем говорить о барьерах для первичного тестирования на ВПЧ именно в Соединенных Штатах. Гм. И если мы доберемся до этого, и если будет интерес, мы можем немного поговорить об управлении ненормальным скринингом. Согласно рекомендациям КПК, мы не будем говорить о вакцинации против ВПЧ, которая является очень важной темой первичной профилактики.Но будет другой разговор. Э-э, мы не собираемся говорить о подавленном иммунитете к ВИЧ или других группах высокого риска. Рекомендации немного отличаются. У них разные факторы риска, распространенность ВПЧ и повышенный риск прогрессирования. Мы собираемся сосредоточиться на США. Так что мы не собираемся слишком много говорить о странах с низким и средним уровнем доходов, хотя именно в этом заключаются мои исследования и страсть к этой теме. Гм И мы не собираемся говорить о вульве или вагинальной дисплазии.Не планирую говорить об инвазивном раке. Но конечно, если есть вопросы, я их приветствую. Честно говоря, это самые простые вопросы, на которые мне ответить онкологу GYN. Но сегодня мы сосредоточены на просмотре. Так действительно, что такое то, что скрининг? Почему мы это делаем на самом деле? Мы делаем это, потому что это вторичная профилактика. Кто-то уже подвергся разоблачению в этом деле. ВПЧ. Мы пытаемся найти и вылечить предраковые поражения, чтобы предотвратить развитие инвазивного рака шейки матки. Гм Предраковое поражение.Есть некоторые дебаты. Гм И, как вы все, наверное, знаете, между тем, что мы считаем предраковым поражением. В частности, C. I. N. Two. Вот и все C.I.N. Два слэша три или C.I.N. Три. Гм И мы посмотрим на некоторые данные об этом. Различные исследования измеряют и сообщают об этом немного по-разному. Хм. Область разногласий, мы поговорим о том, какие тесты у нас есть для выявления предраковых поражений, как лучше стратифицировать риск на основе результатов тестов. И мы поговорим о том, необходимо ли сортировочное тестирование и при каких обстоятельствах? Итак, как я уже сказал, рак шейки матки особенно подходит для каскада скрининга вторичной профилактики из-за медленного прогрессирования инфекции ВПЧ в пластические поражения, а затем в рак шейки матки.Гм. Итак, именно этот патогенез и медленное прогрессирование, гм, делают его действительно пригодным для скрининга. Я кратко расскажу о биологии ВПЧ. Это а. Вирус ДНК. Двухцепочечный ДНК-вирус. Хм. Существует более 30 типов, но на самом деле около 18 или около того, которые связаны с инвазивным плоскоклеточным раком или аденокарциномой. Гм и конкретно матки для этого красиво. Гм И это действительно гены E. Six и E. Seven, которые ответственны за этот ангиогенный потенциал. Что они делают. Вирус имеет эти области в своем геноме, коды для штамма E.Шесть и Е. Семь белков. И они подавляют наши гены-супрессоры опухолей, такие как R. B. и P. 53. И это означает, что мы сами не можем выполнять их нормальную систему сдержек и противовесов. Они не могут остановить рост, они не могут сделать пептоз, они не могут сделать какую-то эссенцию. Таким образом, посредством этого эпигенетического программирования мы видим прогрессирование этого нерегулируемого роста бессмертных клеток и, в конечном итоге, рака. Вот почему мы видим эту прогрессию. Различные штаммы ВПЧ имеют разные риски. Гм из этой прогрессии, и это частично то, как они себя ведут. Гм. Вы видите здесь справа на экране ВПЧ 16 и 18, в частности, они интегрируют свою вирусную ДНК в вирусную ДНК хозяина. Гм, и поэтому они действительно могут выполнять это эпигенетическое программирование лучше, чем более похожие на 611 штаммы, которые не связаны с раком. Э-э, вирусный материал, вирусный ДНК-эпизод, гм, и поэтому не может на самом деле выполнить это эпигенетическое перепрограммирование небольшого количества фона. Я рисую этот каскад для пациентов, когда встречаюсь с ними в поликлинике и говорю с ними о том, как все это происходит, Как мы уходим от обычного обслуживания.две инфекции ВПЧ. Я отмечаю, что в 80% случаев инфекция проходит, около 20% могут прогрессировать до предраковых поражений, которые еще можно регрессировать. На следующем слайде у меня есть цифры для регрессии. Хм, а потом у некоторых может развиться рак. И я буквально обвожу или рисую звездочку на этой прогрессии, когда я консультирую конкретного пациента о том, что я думаю, основываясь на доступных данных, которые мы обычно получаем из совместного тестирования, где, я думаю, они находятся в этом. У этого есть немного чисел. Э-э, это статья от Марка Шиффмана.Он был опубликован в «Ланцете», но цифры, которые я привожу, на самом деле немного отличаются от приведенных. Но это тоже разумные цифры. Хм. Вы видите, что большинство C. I. N. One регрессирует сам по себе. Я цитирую около 10% риска прогрессирования. У C. I. N. To на самом деле более высокая вероятность регрессии, а у CNN три, очевидно. Но в целом я думаю, что разумно говорить о регрессии в пределах от 30 до 40%. Для обоих C. I. N. Два и три. Но там есть некоторая разница. Гм, и прогрессирование, и мы говорим о порядке лет, чтобы прогрессировать до рака.И. Н. Три. Это было немного неэтичное исследование, которое было проведено в Австралии. Этим данным десятилетия, десятилетия и десятилетия. Но была группа пациентов женщин, которые были с CNN три, которые не лечились и наблюдались. Хм И что это показало нам с естественным течением CIN 3, что кумулятивный риск рака шейки матки в возрасте 30 лет здесь составлял около 30%, но для людей с персистирующим заболеванием на отметке от 6 до 24 у них был примерно 50% шанс прогрессирования к раку.Настолько стойкий или или рецидивирующий гм C. I. N. 3, что мы наблюдаем довольно высокий риск прогрессирования в рак, и поэтому окончательно мы думаем о C. I. N. Three как о предраковом поражении, которое действительно требует лечения. Есть некоторые обстоятельства у очень молодых пациентов, когда мы иногда рассматриваем наблюдение для CN 3, но с невероятно плотным наблюдением почти все время неприемлемо не просто лечить cm 3. Я думал, что не буду слишком много говорить о странах с низким и средним уровнем дохода.Просто я быстро скажу, что скрининг зависит от контекста, это зависит от того, где вы находитесь. Это зависит от распространенности как ВПЧ, так и рака шейки матки. Когда вы думаете о том, чтобы сбалансировать риски и вред криотерапии. Значит, они держат ее с крио-пистолетом. Скрининг в США. У нас есть три основных метода, как вы все знаете, у нас есть цитологический мазок Папаниколау. У нас есть первичное тестирование на ВПЧ высокого риска, и у нас есть совместное тестирование гибридной стратегии, которое, конечно же, включает в себя психологию и тестирование на ВПЧ высокого риска. Теперь, если мы проводим соревнование, у вас есть встроенный этап сортировки, у вас есть две точки данных, которые вы можете использовать, чтобы выяснить, кто идет на колоноскопию или нет.Гм. Если вы занимаетесь только цитологией, мы знаем из эксперимента с искусством, что добавление рефлекторного ВПЧ сначала для психологии, такой как вопрос, может быть очень полезным для сортировки. Хм И затем, если вы проводите первичное тестирование на ВПЧ, есть сложная парадигма сортировки. Мы можем немного поговорить об этом позже, чтобы выяснить, кто пойдет на колоноскопию. Хм Итак, я собираюсь начать разговор о рекомендации Целевой группы профилактических служб США. Затем мы поговорим о рекомендациях американского онкологического общества.Гм, и почему я думаю, что они оба довольно разумный метод. Хм, я знаю, что в группе возникла некоторая путаница в отношении того, какие вы знаете, какие какие рекомендации иметь. Итак, мы немного поговорим о различиях и о том, почему они оба действительно, вероятно, являются хорошими способами проверки людей. Гм этот слайд я снял с основной публикации. Хм, это карри, это сцена, первый автор которой был опубликован в Jama в 2018 году, это целевая группа, рекомендации целевой группы профилактических служб США.Таким образом, они рекомендуют начинать скрининг в 21 год, а для 20-летних — 22 года, поскольку ВПЧ настолько распространен, что целевая группа не рекомендует сразу проводить тестирование на ВПЧ. Есть небольшая сноска. Но они рекомендуют только цитологию каждые три года для 20-летних. Есть сноска, гм, что ACOG Sugo и AFCCP, которые являются тремя профессиональными обществами, которые одобрили эти рекомендации, они действительно советуют гм, и целевая группа отмечает это в сноске к этой таблице, первичное тестирование на ВПЧ, одобренное FADA, начиная с 25 лет.И мы увидим это, когда посмотрим на рекомендации, которые могут быть альтернативной цитологией для пациентов среднего риска от 25 до 29 лет. Таким образом, есть признание того, что первичное тестирование на ВПЧ может быть рассмотрено, и мы поговорим о данных, которые сообщили, Утверждение FDA для большинства людей в возрасте от 30 до 65 лет, и рабочая группа в основном имеет три метода. Они не рекомендуют тот или иной из них над другим, но они говорят, что любой из следующих трех является разумным балансом пользы и вреда, только цитология каждые три года.Гм FDA одобрило первичное тестирование на ВПЧ, которое действительно проводится в этой стране. Просто тест на кобальт, мы будем немного говорить об этом или совместном тестировании каждые пять лет, потому что чувствительность отличается, чувствительность выше, и я покажу вам данные для этого, но чувствительность выше для теста на ВПЧ, вам не нужно делать это как можно чаще. В то время как психология, потому что чувствительность ниже, специфичность выше, но чувствительность ниже. Тебе нужно повторять это чаще. Таким образом, любая из этих трех стратегий для 30-65-летних считается разумной.И затем последний пункт, последний пункт оперативной группы, когда можно, когда можно выйти из проверки? Таким образом, 65 считается временем выхода, но за последние 10 лет нужно пройти либо три негативных психологических исследования, либо пять или два каждые пять лет, эм, тест на ВПЧ. Таким образом, они должны быть в курсе последних 10 лет с некоторыми обнадеживающими отрицательными результатами тестирования, чтобы выйти в 65 лет. Таковы рекомендации целевой группы. Рекомендации ACS немного отличаются. Это скопировано с их основной статьи, опубликованной в 2020 году, и их журнала «Рак».Гм, их рекомендация немного отличается, а также немного то же самое. Они рекомендуют начинать скрининг в 25 лет. И они рекомендуют первичное тестирование на ВПЧ. Так что это не похоже на целевую группу, которая на самом деле реализует любую из трех стратегий для 30-65-летних. Они выходят и на самом деле говорят из-за улучшенной чувствительности. Гм, и я покажу вам еще некоторые данные, чтобы предположить, что первичное тестирование на ВПЧ может быть полезным. Это рекомендуемый тест, который они признают, однако, что из-за наличия утвержденных FDA тестов для первичного скрининга, которые отличаются от одобренных FDA тестов для протеста, потому что их просто не так много, к которым они труднодоступны.Гм Они признают, что совместное тестирование или цитология приемлемы гм Это слово? Они используют приемлемые альтернативы для скрининга рака шейки матки. Гм и так там немного разные и немного такие же. Хм, а затем они также рекомендуют остановиться на 65-летнем возрасте с адекватным скринингом в течение предшествующего десятилетнего периода. Так что я думаю, что здесь больше похожего, чем различного. Основное различие на самом деле заключается в том, когда начинать кричать, и в том, что CS действительно занимает позицию и рекомендует первичное тестирование на ВПЧ.Сейчас. Как насчет этих бедных 20-24-летних? Отказываемся ли мы от них, если не проверяем их? Гм, в своей основной статье, которую они пишут по этому поводу, Американское онкологическое общество говорит о том, что на самом деле причина, по которой они повысили этот возраст, заключается в том, что существует более высокая распространенность ВПЧ высокого риска среди женщин, менее 25 лет при использовании теста на ВПЧ. Вы поймаете гораздо больше людей, которым потребуется гораздо больше куска холодной пасты. А неужели спрашивали за какую пользу? На самом деле рака шейки матки всего 250.8 Процент, к сожалению, инцидента составляет 0,8% среди 20-24-летних, что, как вы знаете, сильно отличается от остальных остальных возрастных групп. Так что на самом деле у этих молодых женщин обнаруживается очень небольшая доля рака шейки матки, а ВПЧ гораздо больше. Так что, и они также, гм, они также говорят об этом в своем обсуждении, гм, что они как бы постулируют, что с увеличением охвата вакцинацией, гм, они действительно думают, что эти молодые женщины, достигшие возраста скрининга, будут подвергаться меньшему риску заражения ВПЧ.Так что это был еще один пункт в их обсуждении. Итак, это занятный слайд, но вы можете вернуться к нему, взглянуть на него, если есть одно исследование, на которое вы хотите взглянуть, и нет или или или есть какая-то ссылка, чтобы проинформировать об этом. Я думаю, что суд над Афиной — это испытание, чтобы узнать. О, это испытание. Это было опубликовано несколько лет назад, я думаю, что это выглядит так, как будто я вырезал дату, но я думаю, что это был 2016 год или где-то там? Эм Томас Райт — первый автор этой книги. Это было огромное исследование, 40 с лишним 1000 женщин.Это было своего рода проверочное исследование, и каждая из этих 40 000 женщин, участвовавших в испытании, прошла психологический скрининг с помощью Кобуса, э-э, первично, но это не совсем первичный скрининг на ВПЧ, потому что у всех были все методы, но они прошли цитологический скрининг, тестирование на ВПЧ Кобус. . Гм И это был сложный алгоритм, но за людьми следили даже за частью нормальных людей с холодными макаронами П и даже с биопсией. Так что у них были нормальные люди, чтобы попытаться оценить чувствительность. Гм И в основном их главный вывод заключался в том, что первичное тестирование на ВПЧ действительно выявило больше случаев C.И. Н. Три. Хм, тогда либо цитология, либо гибридная стратегия, стратегия тестирования Со, но потребовалось гораздо больше ошибок, копий этой таблицы. Я решил выделить чувствительность в этой таблице, чтобы вы могли видеть. Но в основном вы видите чувствительность через 33 года после начала скрининга с помощью Эм, если бы у всех были все три разные, все в порядке, у всех была бы цитология и тестирование на ВПЧ. Но ради анализа авторы смогли показать, что если бы у них была только цитология, вот какой была бы чувствительность, если бы у них был только Cobus HPV, вот какая была бы чувствительность.И если бы у них было и то, и другое в соответствии с алгоритмами сортировки, вы можете сослаться на документ, чтобы увидеть очень сложную диаграмму. Но конец этого был в три года, чувствительность была лучше всего 76% для CIN. Три для первичной стратегии HPV. Тест Cobus. хорошо 61 для совместного теста и чувствительности не так хорошо для психологии, и поэтому психология должна быть сделана чаще, как вы видели в предыдущие десятилетия для прогрессирования рака. Таким образом, несмотря на то, что чувствительность не так хороша для цитологии, если вы будете делать это чаще, конечный результат будет в порядке.Это другое испытание. Это рандомизированное канадское исследование, названное фокальным исследованием Джины Огилви, с указанием основного автора. У них также очень сложная диаграмма консорта. Я поместил это здесь, чтобы вы могли видеть, насколько это сложно. Но в основном женщины были рандомизированы в этом испытании либо на цитологию, либо на первичный ВПЧ. Таким образом, здесь не было теста um co, но их основной вывод заключался в том, что скрининг на основе ВПЧ привел к более низкой вероятности, и вы можете видеть разделение кривых здесь через два года C A.N. Три связаны с первичным тестированием на ВПЧ. Они использовали гибридный захват, чтобы не кобус немного отличался. Гм как канадский суд. Э-э, тогда психология и э-э-э инцидент сообщается здесь. Вы можете увидеть их соотношение рисков и значительный доверительный интервал, сравнивая группу вмешательства, проводившую первичное тестирование на ВПЧ, с цитологией, которая была контрольной группой. Итак, это испытание, а также испытание Афины, я думаю, это два лучших испытания. Это было в США. Фокальное исследование в Канаде поддерживало движение к первичному первичному тестированию на ВПЧ, учитывая лучшую чувствительность.Так почему же мы еще этого не сделали? Почему мы в Соединенных Штатах не перешли к первичному тестированию на ВПЧ? Что ж, существует не так много утвержденных FDA тестов, специфичных для первичного ВПЧ. У меня есть таблица, которую я взял из последних данных, но у меня есть таблица того, какие разные тесты проходят на встречной стороне и в полете, и я покажу вам, что на самом деле тест Кобуса — это тот, который чаще всего используется для первичного ВПЧ, но это просто не так много тестов, и к ним сложнее получить доступ.Гм, всевозможные патологоанатомы там заняты, возможно, глядя в зеркала, и наши больничные системы и наши лабораторные структуры вложили значительные средства и создали инфраструктуру для скрининга на основе мазка или совместного тестирования. Поэтому необходимы значительные изменения инфраструктуры. Гм, и это было отмечено во многих, многих э-э-м документах, которые были написаны, э-м, документы по моделированию, и гм, и критические анализы, в которых рассматривалась стратегия, отмечали, что ограниченный доступ к первичному гм-тестированию на ВПЧ высокого риска вызывает особую озабоченность в исторически и одновременно маргинализированные люди, живущие в сельской местности в обеспеченном ресурсами сообществе, т. е. цветные люди, у которых непропорционально выше заболеваемость раком шейки матки, заболеваемость и смертность.Итак, мы еще не готовы совершить этот прыжок, и это признается во всех, во всех, во всех руководящих принципах, которые, гм, психология была основой на протяжении столь долгого времени нашего скрининга. Все рекомендации работали для сортировки тестов. Это таблица, в которой рассматриваются различные типы тестов на ВПЧ. В нашей клинике мы используем Optima um HPV 16 18 45 с совместным тестом с цитологией. Он специально сообщает о 16 и 45, а затем дает вам другую категорию. И затем, конечно, у нас также есть результаты цитологии, потому что это тесты, одобренные FDA, гм, для протеста, гм, для первичного тестирования на ВПЧ, кобус, гм, одобрено FDA? Вы можете видеть, что у одобренных FDA есть этот маленький символ, они даже не знают, что это за символ, но имеют этот маленький символ здесь.Так что это просто Кобус и БТ на чистоте. Хм, я не думаю, что видел этот тест. Это еще один, одобренный FDA. Шеф-эксперт EOD. Генный эксперт. Хм, тест на ВПЧ действительно интересен, особенно для использования в странах с низким и средним уровнем дохода. Гм Это время выполнения этого теста составляет один час, и вы получите отчет о ВПЧ высокого риска, э-э, 16, 18, 45 или другом. Хм И самое интересное в этом тесте то, что его можно проводить почти как тест на месте. Это не одобрено FDA, это W.H. O. Предварительно квалифицированный гм, и он больше использовался в международных условиях, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода, у которых нет ресурсов для проведения цитологии. Хм. Так что да, это немного другое приложение, но вы видите, что тестов не так много, а наличие тестов с цитологией — это те, которые я чаще видел в наших клиниках. Второй гибридный захват также одобрен FADA. Это тест, который канадское исследование использовало для первичного тестирования в фокальном исследовании. Так что я имею в виду потенциально тот, который в будущем вы знаете, надеюсь, что FDA рассмотрит данные и подумает об этом.Но на данный момент у нас ограниченная доступность одобренных FDA тестов. Хм. Итак, мы все довольно привыкли, я думаю, что сортировка от Папаниколау с использованием тестирования на ВПЧ и тестирование генотипа для сортировки, чтобы выяснить, кто идет к корпусной копии или нет. Но что касается первичного скрининга на ВПЧ, я чувствую, что люди немного менее знакомы с тем, каким должен быть этап сортировки, прежде чем переходить к корпусной копии. Итак, это Уорнер ха, онколог ООН из Университета Алабамы, написал эту статью в журнале SCP.Хм, и только что выделил этот алгоритм, чтобы показать, кто, у кого положительный результат на первичный ВПЧ, пойдет на крутой апостроф. Таким образом, вы видите, что есть способ добраться до колоноскопии, даже не сдав мазок Папаниколау. Если они были 1618 положительными, вы знаете из скачка по сравнению с гм, вы знаете, что находитесь в другой другой группе высокого риска, а затем проходите цитологию, чтобы выяснить, если отсюда они переходят к копированию корпуса, а не к тщательному отслеживанию. Я просто немного расскажу о принципах А.Ф.К.П.Мм КПК.Также есть руководящий орган, который дает рекомендации не по скринингу, а по ведению ненормального скрининга. Гм, и они одобрили Целевую группу по профилактическим услугам Соединенных Штатов, но также имеют сноску со звездочкой, где они также поддерживают первичный скрининг на ВПЧ в возрасте 20 5–29 лет. Так что, похоже, они все равно поддерживают обе стратегии. Но это группа, которая дает рекомендации по управлению ненормальным скринингом, и именно у них есть приложение, которое вы можете использовать или не использовать на своем телефоне.Хм, они переделали все свои алгоритмы в 2019 году, и я просто хочу пойти, просто хочу объяснить пару небольших моментов с этим. Главное, что в новых рекомендациях по консенсусу они основывали все свои рекомендации для тех, кто обращается к копии Капуса, на основе оценок риска на основе реальных данных. Они использовали когорту Kaiser Permanente в Северной Калифорнии, чтобы выяснить, на чем был основан непосредственный риск CIN 3, на основании которого я сейчас покажу вам таблицу, но SAN представляет собой целый поток данных о психологии и ВПЧ. .Тестовое задание. Хм. Итак, все это основано на реальных данных, и они также подтвердили свои рекомендации из пробной когорты Athena, которую мы рассматривали ранее. Кроме того, это также национальная программа страхования от рака молочной железы и рака шейки матки. Группа Кайзера, которая является своего рода группой рабочего класса. Национальная группа по раку молочной железы и шейки матки, которая, как правило, является группой, которая в остальном соответствует критериям для участия в Medicaid или MeDI cal и в испытании Athena, которое представляет собой клиническое испытание.Так что довольно хорошее соответствие. Гм. И они решили, что порогом будет риск 4%. Так что, каков бы ни был скрининговый тест, есть ли риск 4% или выше немедленного наличия C. I. N. Three. Это люди, которым рекомендована колоноскопия. Вот это я и хотел особо подчеркнуть. Гм. Это просто список изменений по сравнению с предыдущим, действительно основанный на риске, а не на результатах. Хм, хотя они родственники. Колоноскопия может быть отложена для некоторых пациентов. Гм Есть некоторые ситуации, когда co po не может быть рекомендовано, может быть рекомендовано ускоренное лечение, основанное на этих оценках риска.Гм Есть некоторые интересные изменения для A. I. S. Гм, о которых мы поговорим, и они проводят абляцию там там, они не так сильно поддерживают абляцию как лезвие терапии гм для H. L. C. I. N. 23 и действительно рекомендуют удаление. Мы можем немного поговорить об абляции и эксцизии, если люди хотят. Хм, но КПК склоняется к тому, чтобы рекомендовать исключительные диагностические процедуры. Гм Но все еще дает лезвие терапии. Хм Приемлемое замечание, особенно для тех, кто планирует беременность на будущее.Немного истории, различия в сообщениях о патологии. Гм Изменилось ли наблюдение немного после высокого риска? Гм. И наблюдение только за психологией в данный момент не рекомендуется. Гм. Это последнее, что я вам покажу, а затем у меня есть куча алгоритмов, использующих алгоритмы TCP, и мы можем поговорить о них, если у людей возникнут конкретные вопросы. Но это документ Линуса Ченга, на котором основаны рекомендации 2019 года, в основном он основан на этой таблице рисков. Итак, если вы идете в С.E.C.P., все эти статьи находятся в свободном доступе, и руководство 2019 года основано на их основной статье, написанной Перкинсом, со всеми алгоритмами, а в статье Линуса Ченга есть таблица рисков. Итак, вы видите здесь, что это различные комбинации результатов ВПЧ и результатов ВПЧ высокого риска, а также результатов цитологии, и это непосредственный риск c. а. н. три, которые выше этого 4% порога. Таким образом, любая комбинация этого скрининга будет затем сортировать кого-то для немедленного копирования. Остальное, остальные мои слайды в основном отличаются друг от друга.Алгоритмы П. Я остановлюсь на мгновение на A.I.S. One, потому что это было изменением. Хм, я пройдусь по этому с вами, ребята, а потом я просто остановлюсь на вопросы. Гм Но это было изменение, и я думаю, что к лучшему это дает людям выход из необходимости гистерэктомии. Э-э, если все близко, последующий скрининг — это нормально. Так что для A. I. S. Мы бы никогда не сделали абляцию для I. S. Аденокарциномы внутри тоже. Мы хотели бы диагностическую исключительную процедуру.И вы видите, что они не рекомендуют говорить не о подсчете холодного ножа, а о исключительной диагностической процедуре. Скачок допустим, конусность предпочтительнее для оценки маржи, но мы также допустимы. Гм И если отрицательные поля, если кто-то рассматривает будущую фертильность или гм или по какой-либо причине не хочет делать гистерэктомию, плохой кандидат на хирургическое вмешательство что-то в этом роде. Вы можете рассматривать каждые шесть месяцев в течение трех лет. Гм, сделать совместный тест, pAP-тестирование на ВПЧ и закончить хирургическим выскабливанием гм Если нормально, каждые шесть месяцев в течение трех лет.Гм И затем ежегодно в течение пары лет это действительно дает возможность продолжать тщательный скрининг каждые три года на основе ВПЧ в течение по крайней мере 25 лет. Таким образом, есть путь, который не обязательно заканчивается гистерэктомией для женщин или людей с а. является. Для нас это была большая разница.

Быстрый скрининг с помощью искусственного интеллекта плоскоклеточного внутриэпителиального поражения шейки матки высокой степени и диагностики и планирования лечения плоскоклеточного рака

сократить время вычислений.Предлагаемый каскадный многоуровневый метод использует стратегию «от грубого к точному» для быстрого определения интересующих тканей и выполнения семантической сегментации для идентификации HSIL; на грубом уровне проводится быстрая локализация интересующих тканей, а на тонком уровне HSIL идентифицируются на основе результатов быстрого скрининга интересующих тканей. Каркас предлагаемого метода показан на рис. 5.

Рис. 5

Каркас системы. Каждый WSI отформатирован в пирамидальную структуру данных на основе плиток, а вероятность HSIL на каждом уровне генерируется многоуровневой структурой глубокого обучения.Многоуровневая карта внимания вычисляется для выбора интересующих плиток на каждом следующем уровне с помощью модели селектора плиток \(\lambda \), а результат сегментации HSIL генерируется моделью глубокого обучения последнего слоя \(M_{N} (t’_{N,i,j}(x,y))\).

Каскадная многоуровневая структура глубокого обучения

Для эффективной работы с гигапиксельными данными каждый WSI форматируется в мозаичную пирамидальную структуру данных, которая обозначается \(\mathcal {T}=\left\{ t_{l ,i,j} \right\} _{~l=1,\ldots ,N}\) где l — текущий уровень, а i j — индекс строки и столбца тайла.\(\mathcal {M}=\left\{ M_{1} ,\ldots ,M_{N}\right\} \) представляет набор моделей глубокого обучения \(M_{l}\) на каждом уровне, и улучшенная полностью сверточная сеть разработана как базовая модель глубокого обучения, которая описана в следующем разделе. Выходом \(M_{l}\) являются вероятности HSIL \(P_{l,i,j}\) на уровне l , которые используются для создания карты внимания \(a_{l,i, j}\). Многослойная карта внимания \(\mathcal {A}=\{a_{l,i,j}\}_{~l=1,\ldots,N-1}\) вычисляется для выбора интересующих плиток \ (\mathcal {T’}=\left\{ t’_{l,i,j}\right\} _{~l=2,\ldots ,N}\) для дальнейшей проверки на каждом следующем уровне \(l +1\) с помощью модели селектора плитки \(\lambda \).Результат сегментации HSIL \(\mathcal {S}_{N,i,j}(x,y)\) генерируется \(M_{N}(t’_{N,i,j}(x, у))\).

Для инициализации \(t_{1,i,j}\) , т.е. плитки на первом уровне, обрабатывается \(M_{1}\) для генерации вероятностей HSIL \(P_{1,i ,j}\), как показано в уравнении (5).

$$\begin{align} P_{1,i,j}\left(x,y\right) =M_{1}\left(t_{1,i,j}\left(x,y\right ) \right) \end{align}$$

(5)

Выходом \(M_{l}\) являются вероятности HSIL \(P_{l,i,j}\) на уровне l , которые используются для создания карты внимания \(a_{l, я, j}\).Если вероятность любого пикселя \(t_{l,i,j}\) больше или равна \(\alpha \), установите карту внимания \(a_{l,i,j}\) этой плитки до 1, как показано в уравнении. (6). В практическом случае \(\alpha \) устанавливается равным 0,5.

$$\begin{aligned} a_{l,i,j}=\left\{ \begin{matrix} 1 &{}, max(P_{l,i,j}(x,y))\ge \alpha \\ 0 &{}, иначе \end{matrix}\right. \end{выровнено}$$

(6)

Для рендеринга интересующих плиток \(t’_{l,i,j}\) на каждом следующем уровне карта внимания \(a_{l-1}\) на предыдущем уровне \(l-1\) используется моделью селектора плитки \(\lambda _{l-1}\) с функцией отображения, как показано в уравнении.2\) квадратов), и если модель сегментации на этом уровне подтвердит, что какой-либо пиксель этой плитки, связанный с единицей внимания, является целью, единицы внимания будут активированы для выбора плиток для следующего уровня.

Для последующих уровней \((l=\left[ 2, N \right] )\), \(t’_{l,i,j}\) обрабатывается \(M_{l}\) до генерировать вероятности HSIL \(P_{l,i,j}\), как показано в уравнении. (8). Затем \(P_{l,i,j}\) используется для создания карты внимания \(a_{l,i,j}\) для идентификации интересующих плиток на следующем уровне с помощью модели селектора плиток \(\ lambda _{l}\) для генерации \(t’_{l+1,i,j}\), как сформулировано в уравнениях.(6)–(7).

$$\begin{aligned} P_{l,i,j}\left(x,y\right) =M_{l}(t’_{l,i,j}(x,y)) \end {выровнено}$$

(8)

На уровне N выбранные плитки \(t’_{N,i,j}\) производят вероятности \(P_{N,i,j}\) с помощью (8). Результат сегментации HSIL \(\mathcal {S}_{N,i,j}(x,y)\) генерируется \(M_{N}\) с использованием \(t’_{N,i,j }(x,y)\), как показано в уравнении (9).

$$\begin{aligned} \mathcal {S}_{N,i,j}\left( x,y \right) = \left\{ \begin{matrix} t’_{N,i,j }(x,y)&{}, ~M_{N}(t’_{N,i,j}(x,y))\ge \alpha \\ \phi &{}, иначе \end{matrix} \правильно.\end{выровнено}$$

(9)

Модифицированный FCN для сегментации HSIL или выше (SQCC)

Полностью сверточная сеть (FCN) доказала свою эффективность при патологии, такой как сегментация ядер на изображениях 47 , подсчет клеток в различных видах микроскопических изображений 48 и невропатология 49 . Полностью сверточная сеть (FCN) 50 в основном состоит из 18 слоев свертки (за каждым слоем свертки следует слой RELU), пяти слоев объединения для понижения частоты дискретизации, слоя SoftMax и трех слоев повышения частоты дискретизации, а именно FCN-8s, FCN- 16s и модели FCN-32s, образующие трехпотоковую сеть, в которой выходные данные каждого потока объединяются для формирования конечного вывода.Архитектура предлагаемого FCN показана в таблице 6. В нашем предварительном тесте с использованием набора данных о легких, предоставленного задачей автоматического обнаружения и классификации рака в гистопатологии всего слайда легкого, которая проводится в рамках Международного симпозиума IEEE по биомедицинской визуализации (ISBI) в 2019 г. 51 , мы обнаруживаем, что однопотоковые FCN-32 могут избежать чрезмерно фрагментированных результатов сегментации по сравнению с исходной трехпотоковой сетью, как показано на рис. 6. Кроме того, затраты на обучение и время логического вывода значительно экономятся.В этом исследовании мы разработали улучшенную FCN в качестве базовой модели глубокого обучения, используя однопотоковые FCN-32 в качестве слоев повышающей дискретизации, чтобы улучшить результат сегментации, снизить потребление памяти графическим процессором и ускорить время обучения и вывода ИИ.

Таблица 6. Архитектура предлагаемой сети глубокого обучения. Рисунок 6

Сравнение результатов сегментации трех слоев FCN без выборки. Результаты ( a ) FCN-8 и ( b ) FCN-16 слишком фрагментированы.( c ) Для сравнения, результаты FCN-32 наиболее близки к эталонному стандарту.

Разрыв дицентриков при слиянии теломер

  1. Стефан Маркан1
  1. Commissariat à l’Énergie Atomique, Direction des Sciences du Vivant/Institut de Radiobiologie Cellulaire et Moléculaire/Service Instabilité Génétique Réparation et Recombinaison/Laboratoire Télmère et Réparation du Chromosome, Fontenay-aux-roses 92260, Франция; и Centre National de la Recherche Scientifique, UMR217, Fontenay-aux-roses 92260, Франция.

Аннотация

Ингибирование негомологичного соединения концов (NHEJ) на теломерах гарантирует, что нативные концы хромосом не сливаются друг с другом.Но возникновение и последствия редких слияний теломер изучены недостаточно. Особенно неясно, происходит ли слияние теломер могут быть обработаны для восстановления концов теломер. Здесь мы обращаемся к поведению отдельных дицентриков, образованных слиянием теломер. в дрожжах Saccharomyces cerevisiae . Наш подход заключался в том, чтобы сначала стабилизировать и усилить слияния между двумя хромосомами путем временной инактивации одной центромеры. Затем мы проанализировали разрыв дицентриков после реактивации центромер.Неожиданно дицентрики часто разрываются на теломерах. слияния во время прохождения через митоз, процесс, который восстанавливает родительские хромосомы. Этот непредвиденный результат предполагает путь спасения, способный обрабатывать слияния теломер и поддерживать ингибирование NHEJ на теломерах.

Ключевые слова:

Теломеры представляют собой ДНК-белковые комплексы на концах линейных хромосом. Они решают проблему конечной репликации, в результате из полуконсервативной репликации ДНК (Walmsley et al.1983 год; Грейдер и Блэкберн, 1985 г.; Шор и Бьянки, 2009 г.). Они также защищают нативные концы хромосом от репарации повреждений ДНК и путей контрольных точек, которые воздействуют на сгенерированные концы. двухцепочечными разрывами (de Lange 2009). Эволюция по-разному решала эти проблемы у прокариот и у эукариот. У некоторых бактерий и вирусов хромосомы линейны и имеют ковалентно замкнутые шпилечные концы теломер. Репликация производит инвертированные повторы, которые перерабатываются в две ковалентно замкнутые шпильки с помощью специализированной резольвазы (Aihara et al.2007). Другими словами, у этих прокариотических организмов разрыв слитых теломер является нормальной частью репликации хромосом. и цикл сегрегации. У эукариот теломеры представляют собой стабильные открытые двухцепочечные концы. В большинстве случаев они отображают короткую 3′ одноцепочечный выступ, а их последовательности состоят из ориентированного короткого G-богатого повторяющегося мотива (например, TG 1–3 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и TTAGGG у позвоночных). Повторяющиеся мотивы позволяют сконцентрироваться специализированным белкам, которые узнают их и устанавливают. теломерные функции.

Одной из функций теломер у эукариот является предотвращение слияния за счет негомологичного соединения концов (NHEJ) двухцепочечного разрыва. путь восстановления (Riha et al. 2006). Обычная роль NHEJ состоит в том, чтобы слить два конца двухцепочечного разрыва. NHEJ требует трех консервативных факторов: KU ДНК-связывающий белок; комплекс Rad50–Mre11–Xrs2 NBS1 ; и лигаза 4 с ее кофакторами Lif1 XRCC4 и Nej1 CERNU/XLF (Daley et al.2005 г.; Каллебаут и др. 2006 г.; Денг и др. 2009 г.; Расс и др. 2009 г.; Се и др. 2009). Ингибирование NHEJ на теломерах обеспечивается белками, связанными с двухцепочечными теломерными повторами. В делении дрожжей Schizosaccharomyces pombe белок Taz1 связывается с теломерной ДНК и рекрутирует белок Rap1. И Taz1, и Rap1 необходимы для ингибирования NHEJ. (Феррейра и Купер, 2001; Миллер и др., 2005). У млекопитающих TRF2, ортолог Taz1, рекрутирует RAP1 на теломеры, и как TRF2, так и RAP1 устанавливают ингибирование NHEJ, вероятно. более чем одним путем (van Steensel et al.1998 год; Смогоржевская и др. 2002 г.; Челли и де Ланге, 2005 г .; Бэ и Бауманн, 2007 г.; Сарти и др. 2009). У S. cerevisiae белок Rap1 напрямую связывается с последовательностями теломер и устанавливает несколько параллельных путей для ингибирования NHEJ (Pardo and Marcand 2005; Marcand et al. 2008). Синергия между различными путями гарантирует, что слияния остаются редкими. В отсутствие теломер, опосредованных теломеразой удлинения, слияния происходят в основном между чрезвычайно короткими теломерами, как это наблюдается у дрожжей (Chan and Blackburn 2003; Mieczkowski et al.2003), растения (Heacock et al. 2004), черви (Lowden et al. 2008) и клетки человека (Capper et al. 2007). Однако частоты слияния теломер в физиологических условиях дикого типа пока неизвестны.

Слияние теломер между хромосомами приводит к дицентрическим хромосомам, ожидаемые пагубные последствия которых наблюдаются в несколько экспериментальных ситуаций. Например, ингибирование TRF2 в клетках человека приводит к возникновению мостиков анафазы (van Steensel et al.1998). У мышей клетки печени с экстенсивным слиянием теломер, индуцированным потерей TRF2, не могут нормально проходить через анафазу (Denchi et al. 2006). У делящихся дрожжей, лишенных Taz1, и у почкующихся дрожжей с условным мутантом Rap1 слияние теломер вызывает некоторую гибель клеток. (Феррейра и Купер, 2001; Пардо и Марканд, 2005). Наиболее часто изучаемые дицентрики образуются в результате перегруппировок, индуцированных двухцепочечным разрывом, и впервые были описаны Барбара МакКлинток в 1940-х годах (McClintock 1941, 1942).Они образуют анафазные мостики, которые разрываются где-то между двумя центромерами, вызывая дальнейшие перестройки и геном. нестабильность, которая в конечном итоге приводит к гибели клеток (Bajer 1964; Mann and Davis 1983; Haber et al. 1984; Surosky and Tye 1985; Koshland et al. 1987; Hill and Bloom 1989; Kramer et al. 1994; Jannink et al. 1996). ; Ло и др., 2002; Хан и др., 2009; Пэк и др., 2009; Пеннанах и Колоднер, 2009). Механизм разрушения дицентриков неизвестен. Высокая эластичность митотических хромосом не предполагает простого механического резка силами шпинделя (Marko 2008).

Интересно, что слияния теломер, которые происходят спонтанно в зародышевой линии, иногда могут стабилизироваться. Пример на человеке эволюцией является хромосома 2, которая возникает в результате слияния двух хромосом, которые различаются у обезьян (Lejeune et al., 1973). Теломерные повторы «голова к голове» все еще присутствуют в точке слияния (IJdo et al. 1991), а одна центромера инактивирована (Avarello et al. 1992). Недавно из делящихся дрожжевых клеток с необратимой делецией центромеры были отобраны отдельные слияния хромосом. (Исии и др.2008). Здесь мы обращаемся к поведению отдельных дицентриков, образованных слиянием теломер у S. cerevisiae . Наш подход заключался в том, чтобы сначала стабилизировать и усилить индивидуальные слияния между двумя хромосомами путем временной инактивации одной из них. центромеры в клетках с частыми слияниями теломер-теломеры. Затем мы проанализировали разрыв дицентриков после реактивации центромер. Неожиданно дицентрики часто разрываются в местах слияния теломер.

Результаты

Отбор индивидуальных слияний теломер

Во-первых, нам нужен был новый инструмент для стабилизации и выбора отдельных слияний теломер.У S. cerevisiae центромера может быть частично инактивирована транскрипцией с индуцируемого галактозой промотора GAL1 , направленного к центромере (Hill and Bloom 1987). Инактивированная центромера отсоединяется от веретена. Когда транскрипция выключена, центромера быстро присоединяется к веретену, и его функция восстанавливается (Tanaka et al. 2005). Инактивация центромер стабилизирует слияние хромосом. Кроме того, это создаст положительный отбор для слияний, поскольку неправильная сегрегация неслитой ацентрической хромосомы будет иметь пагубное влияние на рост клеток и слияние хромосом спасет нормальную сегрегацию и жизнеспособность (Ishii et al.2008). Чтобы повысить строгость этого отбора, мы решили инактивировать центромеру хромосомы 6. Увеличенное число копий этой хромосомы убивает клетки, вероятно, потому, что она несет ген TUB2 , кодирующий субъединицу β тубулина (Katz et al. 1990; Torres et al. 2007). В гаплоидном контексте неправильная сегрегация хромосомы 6 приведет к тому, что одна клетка потеряет хромосому, а одна клетка — с двумя. копии, обе нежизнеспособны. Мы вставили промотор GAL1 с каждой стороны центромеры хромосомы 6 ( CEN6 ) (рис.1А). Как показано на рисунке 1B, рост на среде, содержащей галактозу, частично нарушается, когда один промотор присутствует на одной стороне CEN6 , и дополнительно ингибируется, когда по одному промотору присутствует на каждой стороне CEN6 . На глюкозе транскрипция подавляется, и рост клеток нормальный. В данном исследовании мы решили использовать конструкцию с двумя промоторы GAL1 , поскольку они оказались более эффективными при инактивации CEN6 .

Фигура 1.

Отбор индивидуальных слияний теломер. ( A ) Схематическое изображение хромосомы 6 S. cerevisiae . Y’ представляют собой субтеломерные элементы размером от 5 до 7 т.п.н., присутствующие в одной-четырех копиях примерно половины концов хромосом. Левый конец хромосомы 6 (TEL 6L) содержит по крайней мере один элемент Y’ и субтеломерный элемент X размером ~ 500 п.н., за которым следует элемент размером ~ 10 т.п.н. растягиваться с гомологией с другими субтеломерными областями.Правый конец хромосомы 6 (TEL 6R) содержит элемент X, за которым следует уникальной последовательностью, не имеющей гомологии с остальной частью генома. ( B ) Потеря жизнеспособности клеток в ответ на инактивацию CEN6 посредством транскрипции. Штаммы Lev554 ( CEN6 ), Lev1064 ( CEN6-pGAL1 ), Lev1211 ( pGAL1-CEN6 ) и Lev1212 ( pGAL1-CEN6-pGAL1 ) выращивали в течение ночи на богатой глюкозой10 среде, разводили -кратные серийные разведения, высеянные на синтетические среды, и инкубировали в течение 3 дней (глюкоза) или 4 дня (галактоза) при 30°С.Мутация ade2-1 , присутствующая на этом фоне, заставляет клетки накапливать предшественники пурина, когда они начинают истощать аденин. из среды. Эти предшественники придают красную окраску колониям. Остаются колонии с большой долей больных или мертвых клеток. белый. ( C ) Усиление слияний между теломерами Y’. Штаммы Lev1212 ( RAP1 ), Lev728 [ rap1-(Δ) ] и Lev730 [ rap1-(Δ) lif1-Δ ] экспоненциально выращивали в богатой глюкозой среде (expo.) и позволили достичь стационарной фазы через 6 дней (стат.). Слияния амплифицировали с помощью ПЦР из 28 и 32 циклов с отжигом двух праймеров на Y’-концы. Геномную ДНК из клеток rap1-(Δ) в стационарной фазе последовательно разбавляли для получения полуколичественной оценки относительной частоты слияния. и чувствительности метода. ( D ) Обнаружение методом Саузерн-блоттинга слияний между теломерами Y’ в клетках rap1-(Δ) в стационарной фазе.Геномную ДНК расщепляли XhoI, разделяли в 0,9% агарозном геле и зондировали дистальным Y’-концом. фрагмент. Маркер размера на слева от указан в парах оснований. Средняя длина теломер в клетках rap1-(Δ) составляет ~240 п.н.; т. е. примерно на 60 п.н. короче, чем в клетках дикого типа. Стрелкой отмечено положение слияния теломер Y’-Y’. ( E ) Отбор выживших до инактивации CEN6 в клетках rap1-(Δ) в стационарной фазе (см. Материалы и методы).( F ) Количественная оценка относительной частоты выживших после инактивации CEN6 из трех независимых экспериментов.

Затем мы ввели эту условную центромеру в клетки, где слияние теломер посредством NHEJ является частым, используя ранее описанный RAP1 условный аллель degron, называемый rap1-(Δ) .В клетках rap1-(Δ) уровень белка rap1 снижается, и слияния накапливаются, когда клетки достигают стационарной фазы (Pardo and Marcand 2005). На рисунке 1C показана амплификация слитых теломер с помощью ПЦР с отжигом двух праймеров на концах последовательностей Y’, субтеломерных элементы, присутствующие на концах примерно половины хромосом в S. cerevisiae (Louis and Haber 1992). Слияния легко амплифицируются из клеток rap1-(Δ) , достигших стационарной фазы, но не из клеток RAP1 или из клеток rap1-(Δ) lif1-Δ , дефектных по NHEJ.В клетках rap1-(Δ), растущих экспоненциально, слияния возникают как минимум в 100 раз реже, чем в стационарной фазе. Слияния между теломеры также должны быть обнаружены Саузерн-блоттингом, если их частота достаточно высока — метод, впервые использованный в клетках человека. (ван Стенсел и др., 1998). У дрожжей теломеры Y’ демонстрируют консервативный сайт рестрикции XhoI на расстоянии 850–900 пар оснований (п.н.) от начала. теломерных повторов TG 1–3 (рис.1А). На рис. 1D показано, что в клетках rap1-(Δ), достигших стационарной фазы, можно обнаружить новый мазок, размер которого примерно в два раза превышает средний размер теломерных клеток XhoI. фрагменты рестрикции в этих клетках. Этот мазок не обнаруживается в клетках rap1-(Δ)lif1-Δ , дефектных по NHEJ. Интенсивность мазка составляет ~3% сигнала от концов Y’, что предполагает среднее значение одного слияние двух теломер Y’ в четверти или трети из клеток rap1-(Δ) в стационарной фазе, предполагая случайное распределение в популяции.

При распределении стационарных клеток rap1-(Δ) с условным CEN6 на галактозосодержащие чашки выжившие до инактивации CEN6 появляются с частотой ~0,2% (рис. 1E,F). Выжившие по крайней мере в 50 раз реже встречаются в клетках rap1-(Δ) , растущих экспоненциально, и в клетках rap1-(Δ) lif1-Δ , находящихся в стационарной фазе, что указывает на общую корреляцию между выжившими после инактивации CEN6 и присутствием слияния теломер в клетках до инактивации CEN6 .Поскольку S. cerevisiae имеет 16 хромосом, наша предыдущая оценка из рисунка 1D, согласно которой имеется по крайней мере одно слияние в четверти стационарных клеток rap1-(Δ) , предсказывает, что ∼3% клеток должны иметь слитую хромосому 6. к другой хромосоме, если предположить, что шансы равны среди все теломеры. Несоответствие между этим простым прогнозом и наблюдаемой частотой выживших в 0,2% предполагает, что в стационарных клетках rap1-(Δ) некоторые теломеры могут быть более подвержены воздействию NHEJ, чем теломеры хромосомы 6, или слияние между двумя концами хромосомы 6, не выбранные в анализе, могут встречаться чаще, чем слияния между хромосомой 6 и другой хромосомой.Кроме того, слияния могут быть неравномерно распределены между клетками.

Характеристика индивидуальных слияний теломер

Кариотип восьми индивидуальных клонов, отобранных на галактозе из стационарных клеток rap1-(Δ) , анализировали с помощью электрофореза в импульсном поле (рис. 2А, левая панель). Во всех клонах хромосома 6, а также еще одна хромосома отсутствуют в их нативном положении, и одна появляется новая хромосома размером, близким к сумме двух недостающих хромосом.Например, в клоне II хромосомы 6 (~270 т.п.н.) и 9 (~440 т.п.н.) отсутствуют, а между 670 и 750 т.п.н. появляется новая хромосома, что указывает на то, что хромосомы 6 и 9 сливаются вместе. Гибридизация с зондом из хромосомы 6 показывает для каждого клона основной сигнал в положении новой хромосомы (рис. 2А, правая панель). Более слабые сигналы присутствуют в нативном положении хромосомы 6 и примерно в 550 т.п.н., что примерно в два раза превышает размер хромосома 6 (см. ниже).

Фигура 2.

Идентификация восьми отдельных слияний теломер. ( А ) Штаммы Lev1212 ( RAP1 ), Lev728 [ rap1-(Δ) ] и Lev730 [ rap1-(Δ) lif1-Δ ] выращивали на глюкозосодержащей синтетической среде, а клоны I –VIII, отобранные на галактозе из Lev728, выращены в галактозосодержащих синтетическая среда.Хромосомы разделяли с помощью PFGE, метили бромистым этидием ( слева, панель ) и зондировали фрагментом хромосомы 6 ( справа, панель ). Размер и положение нативных хромосом помечены на слева . Звездочкой отмечено положение слабой полосы ∼550 т.п.н. ( B ) Детектирование слияний с TEL 6R Саузерн-блоттингом. Геномную ДНК расщепляли XhoI, разделяли в 0,9% агарозном геле, и зондировали TEL 6R-специфическим фрагментом.Маркер размера на слева от указан в парах оснований. Звездочкой отмечено положение слабой полосы ∼4 т.п.н. ( C ) Обнаружение слияний с теломерами Y’ с помощью Саузерн-блоттинга. Геномную ДНК расщепляли XhoI, разделяли в 0,9% агарозной среде. геле и зондировали дистальным фрагментом Y’. Маркер размера на слева от указан в парах оснований. Средняя длина теломер в клетках rap1-(Δ), выращенных в среде с галактозой, составляет ~180 п.н., что примерно на 60 п.н. короче, чем в тех же клетках, выращенных в среде с глюкозой. среда (данные не показаны).

Для дальнейшей характеристики отдельных слияний мы сначала использовали сайт рестрикции XhoI, присутствующий в 1740 п.н. из теломерных повторов TG 1–3 на правом конце хромосомы 6 (TEL 6R) (рис. 1А). В Саузерн-блоте с зондом TEL 6R (рис. 2B) несколько клонов демонстрируют дискретную полосу размером ∼3 т.п.н. вместо пятен теломер около 2 т.п.н., что указывает на то, что правая теломера хромосомы 6 сливаются в этих клонах.Размер полос предполагает слияние с теломерами Y’. Слабое пятно также видны около 2 кб, а также две слабые дискретные полосы на ~2 кб и ~4 кб (см. ниже). Те же образцы были дополнительно проанализированы с помощью Саузерн-блоттинга с XhoI и Y’-зондом (рис. 2С). Клоны со слиянием, включающим TEL 6R, демонстрируют ту же полосу размером ~3 т.п.н., что и с зондом TEL 6R, подтверждая слияние между TEL 6R и теломера Y’ в этих клонах. Другие клоны отображают новую дискретную полосу между 2 и 2.2 кб, что предполагает слияние между левым концом хромосомы 6 (TEL 6L) и другой теломерой Y’. Клон I отображает полосу выше 4 кб, что предполагает слияние между TEL 6L и теломерой X. Субтеломерные последовательности, соседние со слияниями, были подтверждены с помощью ПЦР с X и праймер Y’ (клон I), с двумя праймерами Y’ (клоны II, III, VI и VIII) и с праймером TEL 6R и Y’ (клоны IV, V, и VII) (данные не показаны).Слияния клонов III и VIII обнаруживают сайт рестрикции на стыке двух теломер, позволяя клонировать и секвенировать каждую теломеру, участвующую в слиянии. Клон III слил две теломеры 147 и 95 п.н. TG 1–3 , а клон VIII имел слитые две теломеры 159 и 152 п.н. (их последовательности приведены в материалах и методах). Таким образом, инактивация одной центромеры позволяет производить отбор и размножение отдельных теломерных слияний с теломерами «голова к голове». повторяется на стыке.Длина повторов в клонированных слияниях короче средней длины теломер в клетках rap1-(Δ) (~240 п.н.). Одна интерпретация заключается в том, что слиянию теломер может способствовать кооперация между снижением Rap1-связывающего участки в самых коротких теломерах и частичная потеря функции rap1-(Δ) мутанта (Pardo and Marcand 2005). Другое предубеждение, которое мы наблюдали среди большего пула выбранных слияний, заключается в том, что TEL 6L сливается чаще, чем TEL. 6R, и что некоторые хромосомы сливаются с хромосомой 6 чаще, чем другие (т.г., хромосома 5) (данные не показаны). Опять же, возможно, что некоторые теломеры относительно более подвержены воздействию NHEJ, чем другие, в стационарных клетках rap1-(Δ). Ограничения организации хромосом в ядре могут также способствовать слиянию между теломерами, которое более взаимодействуют временно (Therizols et al. 2010).

Разрыв дицентриков, образованных слиянием теломер

Затем мы спросили, как ведут себя слитые хромосомы, когда функция CEN6 восстанавливается.Клетки, экспоненциально росшие в присутствии галактозы, переводили на глюкозосодержащую среду в течение одного часа. и два удвоения населения. Анализ кариотипа с помощью электрофореза в импульсном поле показывает два интересных явления (рис. 3А). Во-первых, дицентрики, образованные слившимися хромосомами, исчезают при делении клеток в глюкозе. Это видно по этидии окрашивание бромидом, когда дицентрик не перекрывается с другой хромосомой, и Саузерн-блоттинг. Во-вторых, хромосома вновь появляется в положениях нативных хромосом, которые были слиты вместе в дицентриках.Это повторное появление видно окрашиванием этидием в положении хромосомы 6, а также в положениях хромосом 9, 10 и 14 для клонов II, VII и VIII соответственно. Саузерн-блот подтверждает повторное появление хромосомы 6 в каждом клоне. Он также показывает повторное появление хромосомы 7 для клонов I и IV и хромосомы 5 для клонов III, V и VI. Это указывает на то, что разрыв дицентрического часто происходит в месте слияния теломер, соединяющего две хромосомы, или рядом с ним.Следовательно, слияния теломер ведут себя как горячие точки, особенно склонны к поломке.

Рисунок 3.

Разрыв дицентриков, образованных слиянием теломер. ( A ) Клетки из клонов I–VIII экспоненциально выращивали на синтетической среде, содержащей галактозу (0), и переводили на глюкозосодержащую среду. богатая среда для одного или двух удвоений популяции (1 и 2).(панель Top ) Хромосомы, разделенные с помощью PFGE, были помечены бромистым этидием и последовательно исследованы фрагментами хромосом. 6, 3, 7 и 5. Положение нативной и слитой хромосом отмечено на слева . ( B ) Количественная оценка относительных сигналов от дицентриков и неслитой хромосомы 6, наблюдаемая с помощью зонда хромосомы 6 и из неслитой хромосомы 5 (клоны III, V и VI) или хромосомы 7 (клоны I и IV), наблюдаемые с помощью зондов хромосомы 5 и 7 соответственно.Сигналы были скорректированы на сигнал от хромосомы 3 для каждой дорожки. Для каждой серии указанный процент является относительным к сумме дицентрической и неслитой хромосомы 6 в клетках, выращенных в галактозе.

Для количественной оценки потери дицентриков и повторного появления хромосом в их нативных положениях использовали саузерн-блоттинг. был повторно гибридизован с зондом из хромосомы 3, сигнал которого использовали в качестве внутреннего контроля загрузки (рис.3А). Затем скорректированные сигналы нормализовали к сумме сигналов от дицентрика и от нативной хромосомы. в клетках, растущих с галактозой (точка 0) (рис. 3Б). В среднем дицентрики падают с 93% ± 2% в галактозе до 57% ± 4% и 33% ± 4% после одного и двух удвоений в глюкозе. соответственно. Доля неслитой хромосомы 6 увеличивается с 7% ± 2% в галактозе до 22% ± 4% и 31% ± 7% через одну. и два удвоения глюкозы соответственно.Относительный сигнал, объединенный от неслитой хромосомы 7 в клонах I и IV, и от неслитая хромосома 5 в клонах III, V и VI увеличивается с 10% ± 3% в галактозе до 24% ± 6% и 36% ± 7% после одного и два удвоения глюкозы соответственно. Эта количественная оценка указывает на то, что примерно 40% времени разрушения дицентриков восстанавливается. хромосомы нативного размера.

Обрыв на ТЕЛ 6R

Мы воспользовались уникальной последовательностью рядом с TEL 6R, чтобы получить крупный план слияний клонов IV, V и VII во время первые два подразделения после реактивации CEN6 (рис.4А). Видна потеря слияния около 3 т.п.н., а также появление мазка около 2 т.п.н. Ширина мазка относительно узкий, предполагая, что разрыв происходит внутри теломерных повторов, а не в соседних субтеломерных последовательностях. Дискретная полоса внутри мазка также увеличивается в интенсивности. Эта полоса может свидетельствовать о том, что обрыв часто происходит в предпочтительном месте. позиция; например, на стыке двух теломер.Альтернативное объяснение показано на рисунке 4B (Bateman 1975; Smith 2008). Разрывы могут происходить случайным образом внутри теломерных повторов, но деградация 5′-конца может обнажить соединение в виде одноцепочечной ДНК, что может свернуть саму себя, образуя дискретную полосу размером ∼2 т.п.н. Если эта шпилька заполнена и перевязана, но не вскрыта, репликация во время следующего клеточного цикла создается дицентрическая изохроматида, которая объясняет фрагмент XhoI размером ~4 т.п.н., а также фрагмент ~550 т.п.н. полоса, обнаруженная с помощью зонда хромосомы 6 на хромосомах, разделенных электрофорезом в импульсном поле (рис.2А). Индуцированный разрывом обмен между хроматидами в инвертированных повторах может также создавать дицентрические изохроматиды (Grossi et al. 2001). Отметим, что полоса ∼550 т.п.н. мигрирует немного быстрее, когда правая теломера хромосомы 6 участвует в слиянии чем когда это левая теломера. Это может быть связано с различной конформацией геля во время электрофореза в импульсном поле. (Лаланд и др., 1987).

Рисунок 4.

( A ) Поломка ТЕЛ 6R. Клетки из клонов III, IV, V и VII экспоненциально выращивали в синтетической среде, содержащей галактозу. (0) и переходили на богатую глюкозой среду для одного или двух удвоений популяции (1 и 2). Геномная ДНК была расщеплена с XhoI, разделяли в 0,9% агарозном геле и зондировали фрагментом, специфичным для TEL 6R. Маркер размера на слева от указан в парах оснований.Звездочкой отмечено положение слабой полосы ∼4 т.п.н. ( B ) Модель разрушения и деградации для образования дицентрических изохроматид (Smith 2008). Слитые повторы TG 1–3 выделены красным цветом. ( C ) Модель крестообразного дробления для образования дицентрических изохроматид (Лобачев и др. 2002). ( D ) Нестабильность слияния теломер в моноцентрическом контексте. Хромосомы разделяли с помощью PFGE, метили бромистым этидием. ( слева панель ) и зондировали фрагментом хромосомы 6 ( справа панель ).Положение нативных хромосом помечено слева . Звездочкой отмечено положение слабой полосы ∼550 т.п.н.

Нестабильность слияния теломер в моноцентрическом контексте

Чтобы проверить, был ли остаточный уровень неслитой хромосомы 6 в галактозе следствием частичной активности CEN6 , мы сконструировали штамм rap1-(Δ) с двумя сайтами loxP в прямых повторах с каждой стороны CEN6 .Индукция рекомбиназы CRE удаляет CEN6 из хромосомы и позволяет отобрать выживших, у которых хромосома 6 слита с другой хромосомой (см. Материалы и методы). На рисунке 4D показан пример четырех клонов cen6-Δ (α–δ) рядом с четырьмя другими клонами, где CEN6 инактивирован транскрипцией с двух промоторов pGAL1 (IX–XII). Клон δ представляет собой слияние между TEL 6R и теломерой Y’. Семь других являются слиянием TEL 6L и другая теломера Y’ (данные не показаны).Гибридизация с зондом из хромосомы 6 показывает, что остаточный уровень неслитых хромосома 6 уменьшается примерно в три раза, когда CEN6 делетирована по сравнению с тем, когда она инактивируется транскрипцией (Fig. 4D). Это различие указывает на то, что CEN6 все еще иногда активен, когда транскрипция индуцируется с двух промоторов pGAL1 . Кроме того, стабильный уровень неслитой хромосомы 6 в отсутствие CEN6 , несмотря на его постоянную контрселекцию, указывает на более низкую, но значительную нестабильность слияний теломер.Интересно, полоса около 550 т.п.н. все еще обнаруживается в клонах cen6-Δ . Эта нестабильность в моноцентрическом контексте может происходить из-за палиндромной структуры слияния теломер (Fig. 4C; Szostak 1983; Murray et al. 1988; Lobachev et al. 2002, 2007; Cote and Lewis 2008; Smith 2008).

Поломка происходит во время митоза

В предыдущих экспериментах разрыв наблюдался в пермиссивных условиях мутанта rap1-(Δ) .Чтобы изучить дицентрики, образованные слиянием теломер в контексте, более близком к дикому типу, мы дополнили аллель rap1-(Δ) в клонах II, III, IV и VIII интегративной плазмидой, несущей копию дикого типа RAP1 . . Эта плазмида размером 8 т.п.н. интегрируется в локус URA3 на хромосоме 5, иногда в нескольких копиях. Изученные нами дицентрики имеют один (клоны III и VIII), два (клон II), или четыре (клон IV) копии RAP1 (данные не показаны) (также видно по увеличенной длине хромосомы 5 в клонах II и IV на рис.5А). Комплементированные клетки экспоненциально росли в присутствии галактозы и переводились на глюкозосодержащую среду для одно- и двухкратное удвоение населения. В эксперименте, показанном на рисунке 5A, дицентрики в RAP1 -комплементированных клетках снижаются в среднем с 96% ± 2% в галактозе до 58% ± 4% и 34% ± 5% после одного и двух удвоений глюкозы. соответственно. Доля неслитой хромосомы 6 увеличивается с 4% ± 2% в галактозе до 18% ± 5% и 28% ± 9% через одну. и два удвоения глюкозы соответственно.Это неотличимо от разрушения, наблюдаемого ранее в клетках rap1-(Δ). Этим результатом не исключается причастность Rap1 к этому процессу, поскольку его функция все еще может быть эффективной в пермиссивное состояние мутанта rap1-(Δ) .

Рисунок 5.

Разрыв дицентриков в RAP1 -комплементированных клетках.( A ) Клоны II, III, IV и VIII, трансформированные с помощью pRS306- RAP1 , экспоненциально выращивали на содержащей галактозу синтетической среде (0) и переводили на богатую глюкозу среду для одно или два удвоения популяции (1 и 2). Хромосомы разделяли с помощью PFGE, метили бромистым этидием ( слева, панель ) и исследовали фрагментом хромосомы 6 ( вверху справа, панель ) и фрагментом хромосомы 3 ( внизу справа, панель ).Положения нативных и слитых хромосом отмечены справа . Сигналы были скорректированы на сигнал от хромосомы 3 для каждой дорожки. Для каждой серии указанный процент является относительным к сумме дицентрической и неслитой хромосомы 6 в клетках, выращенных в галактозе. ( B ) Клетки, трансформированные pRS306- RAP1 и экспоненциально выращенные в содержащей галактозу синтетической среде, были синхронизированы в G1 с α-фактором (G1), высвобождаемым в богатую глюкозу среду и либо блокировали в G2/M нокодазолом (G2/M), либо позволяли пройти через митоз до быть заблокированным в следующей G1 с α-фактором (следующей G1).Хромосомы разделяли с помощью PFGE, метили бромистым этидием ( слева, панель ) и исследовали фрагментом хромосомы 6 ( вверху справа, панель ) и фрагментом хромосомы 3 ( внизу справа, панель ). Положения нативных и слитых хромосом отмечены справа . Сигналы были скорректированы на сигнал от хромосомы 3 для каждой дорожки. Для каждой серии указанный процент является относительным к сумме дицентрической и неслитой хромосомы 6 в клетках G1 в галактозе.

Затем мы рассмотрели разрушение дицентриков в RAP1 -комплементированных клетках в течение одного клеточного цикла. Клетки, выращенные с галактозой, синхронизировали в фазе G1 по α-фактору, а затем освобождается от блока в глюкозосодержащей среде. Клетки либо блокировали при переходе G2/M нокодазолом, либо позволяли проходить через митоз до тех пор, пока они не будут снова заблокированы в следующем G1 α-фактором, который был добавлен обратно в среду.Как показано на рисунке 5B переход от G2/M к следующему G1 необходим для разрыва дицентриков и восстановления хромосомы 6. Во время этого перехода примерно половина дицентриков разрушена (от 97% ± 1% в G1 и 88% ± 6% в G2/M до 52% ± 4% в следующем G1), а часть сигнала вновь появляется в положении хромосомы 6 (от 3% ± 1% в G1 и 3% ± 1% в G2/M до 21% ± 6% в следующем G1). Таким образом, разрыв дицентриков при слиянии теломер требует прохождения через митоз.

Восстановление из сплавов

Чтобы проверить их способность восстанавливаться после поломки, RAP1 -комплементированные клетки, содержащие дицентрическую хромосому, экспоненциально выращивали в среде, содержащей галактозу, и помещали в на глюкозосодержащих пластинах. В течение первых трех поколений на глюкозе отдельные клетки разделялись после каждого деление, если они не смогли пройти через цитокинез.Затем клетки оставляли на 3 дня при 30°С для образования колоний. результат показан на рисунке 6A. Черный кружок указывает на отделившуюся клетку, которая не дала начало колонии. Среди 48 исходных клеток каждого клона большинство (26–41) образовали по крайней мере одну колонию. Однако смертность очень часта и, по-видимому, происходит стохастически во время первые дивизии. Интересно, что кризис более острый для клонов II и III, и эта разница коррелирует с меньшая эффективность разрушения при слиянии в течение одного клеточного цикла (рис.5Б). Кроме того, несколько клеток вышли из строя при первом делении, возможно, из-за того, что дицентрик уже был разрушен, а хромосома 6 был неправильно сегрегирован перед посевом.

Рисунок 6.

Восстановление после слияния. ( A ) Клоны II, III, IV и VIII, трансформированные pRS306- RAP1 , экспоненциально выращивали в синтетической среде, содержащей галактозу.(Первое положение от осталось ). Для каждого клона 48 отдельных клеток высевали на богатую глюкозой среду. После каждого из трех первых дивизионов клетки были разделены и перемещены на одну линию, как показано на диаграмме, если только они не смогли пройти через цитокинез в течение нескольких часов. (То есть после первого деления одна ячейка осталась на первой позиции из оставшихся , а другая ячейка была перемещена на пятую позицию из оставшихся .После второго деления одну клетку оставляли на прежнем месте, а другую перемещали в третью или седьмую. позиции из осталось соответственно и т.д.). Колонии фотографировали после инкубации в течение 3 сут при 30°С. Кружок указывает на наличие клетки которые не смогли образовать колонию. 24 колонии, выбранные для анализа PFGE, пронумерованы красным. ( B ) Хромосомы из клонов II, III, IV и VIII, трансформированных pRS306- RAP1 , выращенных в синтетической среде, содержащей галактозу, и из Lev1212 ( RAP1 ) и выбранных 24 колоний, выращенных в богатой глюкозой среде были разделены PFGE, помечены бромистым этидием (, верхняя панель ) и зондировали Y’-фрагментом (, нижняя панель ).Изменения отмечены красными стрелками. В колонии № 1 хромосома 9 появляется в двух экземплярах. В колонии №5 родственник Сигнал Y’ увеличен для хромосомы 6 или 1 и для хромосомы 13 или 16. В колонии № 11 сигнал Y’ уменьшен для хромосомы 5 или 8. В колонии № 22 повышен сигнал Y’ хромосомы 14.

Кариотип 24 колоний, полученных из родословной, анализировали с помощью электрофореза в импульсном поле.Мы выбрали шесть независимых колонии для каждого дицентрика (фиг. 6А). В каждой колонии хромосомы, сформировавшие дицентрики, вновь появляются в своих исходных положениях или очень близко к ним. Единственный исключение составляет колония № 22, где хромосома 14 снова появляется выше, чем ожидалось (рис. 6В). Еще одно интересное изменение наблюдается в колонии № 1, где хромосома 9 появляется в двух копиях. Кроме того, хромосома не участвующие в слияниях, увеличены в размерах в колониях № 5 и № 16.Гибридизация с зондом Y’ показывает, что число копий Y’ не изменились, за исключением колоний № 5, № 11 и № 22 (рис. 6В, нижняя панель). Эти перегруппировки могут возникать в результате разрыва внутри субтеломерной последовательности с последующим индуцированным разрывом репликация с другой субтеломерой.

Обсуждение

В этом исследовании мы наблюдали, что инактивация одной центромеры позволяет выбирать и размножать теломеры «голова к голове». слияния между хромосомами.Когда две центромеры функционируют, дицентрики часто разрываются при слиянии теломер во время прогрессирование через митоз. Эта обработка восстанавливает обе хромосомы и позволяет клеточной линии восстановиться после слияния. Это показывает замечательную устойчивость генома. Это также предполагает неожиданный путь спасения, способный поддержать ингибирование NHEJ. на теломерах. Этот путь обеспечит обратимость слияния теломер, что является общей стратегией проверки биологической функции.Его существование означает, что, несмотря на несколько механизмов, гарантирующих, что NHEJ между теломерами остается маловероятным, редкие слияния иногда встречаются в нормальных клетках. Возникновение слияния может быть значительным во время длительного покоя в спорах или в стационарной фазы, но это еще предстоит определить.

В нашем анализе около 40% дицентриков регенерируют две родительские хромосомы после поломки.Эта частичная эффективность вызывает летальность среди потомства первых делений после образования дицентриков, а иногда и изменения генома, приводящие к этому процесс подвержен ошибкам. На рисунке 7 мы предлагаем сценарий, объясняющий, как клетка с дицентриком либо продолжает делиться, либо умирает, либо восстанавливается после слияния. В анафазе две центромеры каждой сестринской хроматиды могут мигрировать к одному и тому же полюсу, распространяя таким образом дицентрические к следующему поколению в двух потомках.С другой стороны, центромеры каждой сестринской хроматиды могут мигрировать в противоположные стороны. полюсов, образующих два анафазных мостика. Разрыв двух мостов при слиянии восстанавливает нормальный кариотип у двух потомков. (ситуация А). Разрыв одного моста при слиянии и разрыв другого моста вдали от слияния создает одно потомство. отсутствие фрагмента хромосомы, летальная ситуация у гаплоидов (ситуация Б). Другое потомство может восстановить сломанную двойную цепь. заканчиваются репликацией, индуцированной разрывом (Lydeard et al.2007 г.; Смит и др. 2007), воссоздавая дицентрик, но с дополнительной копией одной хромосомы (как показано в колонии № 1 на рис. 6Б). Этот исход был бы летальным, если бы хромосома 6 была дублированной хромосомой (Torres et al. 2007). Разрыв двух перемычек может произойти и вдали от сращения, либо с той же стороны по отношению к сращению (ситуация В) или на противоположных сторонах (ситуация Г). В обоих случаях одно потомство пропускает один или два фрагмента хромосомы и поэтому становится нежизнеспособный.Другое потомство может также восстанавливать два разорванных двухцепочечных конца путем репликации, индуцированной разрывом. Фьюжн от NHEJ также может произойти. В ситуации D, если два разрыва происходят рядом, сплавление двух сломанных концов путем однонитевого отжига воссоздал бы единственную копию дицентрика.

Рисунок 7.

Модель сегрегации и разрушения в течение одного клеточного цикла дицентрика, образованного слиянием теломер.Теломеры синим цветом, а центромеры красным. Предлагаемый сценарий описан во втором абзаце Обсуждения.

Было бы интересно понять, почему поломка сплавов не более эффективна. Возможно, лаборатория штамм, который мы использовали, потерял некоторую пригодность, и что другие штаммы окажутся более способными сделать это.Также возможно, что механизм поломки, изначально подверженный ошибкам, сказывается на стабильности генома даже в отсутствие слияний. Компромисс установил бы эффективность на промежуточном уровне. Избыточность среди механизмов, установленных, чтобы избежать слияния теломер также может способствовать эволюционному дрейфу пути спасения. С другой стороны, мы не можем формально исключить, что функция при естественном отборе происходит не разрыв редких слияний теломер, а другие случайности, порождающие дицентроподобные ситуации, которые могут быть более частыми в клетках дикого типа; например, запутанные теломеры после репликации (Miller et al.2006 г.; Рог и др. 2009).

Механизм разрушения неизвестен, за исключением того, что он происходит в узкой горячей точке (рис. 4А). Эта функция поможет молекулярному пониманию процесса. Можно представить себе несколько рабочих моделей. Поломка в слияние может происходить во время анафазы, когда хроматин под напряжением может быть более восприимчив к разрыву теломерной последовательности. из-за структуры хроматина, другого уровня конденсации, наличия разрывов или рекрутирования нуклеаз теломерными белками.Поломка также может быть вызвана цитокинезом, как это наблюдается для запутанных хромосом в клетках с истощением Top2. дрожжевых клеток (Baxter and Diffley 2008) и для дицентриков, созданных реаранжировками, индуцированными двухцепочечными разрывами в растительных клетках (Bajer 1964). В этой модели слияние будет рекрутироваться в плоскость расщепления во время абсциссии и будет молчать в контрольной точке NoCut , которая задерживает цитокинез в ответ на отставание хроматина (Norden et al. 2006; Mendoza et al. 2009).Было бы интересно рассмотреть, является ли палиндромная структура слияния и Rap1 или факторы, привлеченные Rap1 важны, чтобы создать горячую точку для обрыва. Наконец, пока неизвестно, существует ли путь восстановления слияния теломер. может существовать у других эукариот. Недавно описанный чувствительный к температуре аллель TRF2 может быть инструментом для решения этой проблемы. у млекопитающих (Кониши и де Ланге, 2008). Понимание механизма разрыва дицентриков при слиянии теломер и того, сохраняется ли он в эволюции, должно пролить свет. больше света о том, как клетки поддерживают стабильность генома.

Материалы и методы

Штаммы и плазмиды

Штаммы, используемые в этом исследовании, перечислены в таблице 1. Промоторы GAL1 были вставлены в CEN6 посредством двух последовательных ПЦР-опосредованных трансформаций с использованием pFA6a- Kan MX6 -pGAL1 и pFA6a- skHIS3 MX ​​60. -pGAL1 плазмиды (Longtine et al.1998). Kan-pGAL1 был вставлен на расстоянии 11 п.н. от левой стороны CEN6 . skHIS3-pGAL1 был вставлен на расстоянии 81 п.н. от правой стороны CEN6 . Полученная последовательность окружающих CEN6 в KANr-pGAL1-CEN6-pGAL1-skHIS3 штаммов AAGGAGAAAAAACCCGGATCTCAAAATGATATTTCTTTT CATCACGTGCTATAAAAATAATTATAATTTAAATTTTTTAATATAAATATATAAATTAAAAATAGAAAGTAAAAAAAGAAATTAAAGAAAAAATAGTTTTTGTTTTCCGAAGATGTAAA ATAGGTTGAAAGTTAGAAATTAGTATTATAATAGCAAAAAAAATTTAAAGTTAGAAATTAGAATTTAAGGCTCTACACACGCATTTTGAGATCCGGGTTTTTTCTCCTT.Концы промоторов GAL1 подчеркнуты; последовательность CEN6 выделена жирным шрифтом.

Таблица 1.

Штаммы дрожжей, использованные в этом исследовании

Сайты lox P были вставлены в одни и те же положения вокруг CEN6 посредством двух последовательных ПЦР-опосредованных трансформаций с использованием плазмид pFA6a- klTRP1 MX6 и pFA6a- skHIS3 MX6. klTRP1 находится слева от CEN6 в пределах двух участков lox P, а skHIS3 — справа от CEN6 вне двух участков lox P. Плазмиду pRS315 -pGAL1-CRE трансформировали в штаммы дрожжей Lev1125 и Lev1126.

Плазмида pRS306- RAP1 (Pardo and Marcand 2005) была расщеплена NdeI перед трансформацией в дрожжевые клетки.

Амплификация слияний теломер и теломер с помощью ПЦР

Геномную ДНК получали расщеплением зимолиазой с последующей экстракцией фенолом и хлороформом. Слияния между теломерами Y’ были амплифицировали с двумя следующими 34-мерами: 5′-GTCAGAAAGCCGGGTAAGGTATGACAGCGAGAGT-3′; 5′-GTCAGAAAGCCGGGTAAGGAGTGACAGCGCGAGT-3′.

Эти праймеры отжигаются до конца элементов Y’ 15–20 п.н. от повторов TG 1–3 .Реакции ПЦР (30 мкл) содержали ~10 нг геномной ДНК, 1× буфер Phusion GC, 3% ДМСО, по 200 мкМ dNTP, по 0,5 мкМ каждый праймер и 0,6 ЕД полимеразы Phusion (Finnzymes). Условия: 30 с при 98°C, затем 28 или 32 цикла по 10 с при 98°С, 50 сек при 72°С и 5 мин при 72°С. Продукты (10 мкл) разделяли через 1% агарозный гель, содержащий 0,1 мкг/мл бромистого этидия, и флуоресценцию количественно определяли с помощью устройства формирования изображения Typhoon.

Выбор индивидуальных сплавов

Штаммы Lev1212 ( pGAL1-CEN6-pGAL1 ), Lev728 [ pGAL1-CEN6-pGAL1 rap1-(Δ) ] и Lev730 [ pGAL1-CEN6-pGAL1 rap1-(Δ) lif1-Δ] 9026 посев штрихом на богатую глюкозу среду (YPD), а затем экспоненциальный рост в YPD в течение 24 часов.Части культурам давали достичь насыщения за 6 дней. Клетки, растущие экспоненциально или в стационарной фазе, распределяли при соответствующем разведения на чашках с синтетической средой, содержащей 2% глюкозы, и на чашках с синтетической средой, содержащей 2% галактозы. Колонии подсчитывали после инкубации в течение 4 дней при 30°С. Выживших от Lev728 в стационарной фазе повторно привили на галактозосодержащие чашки с синтетической средой и культивировали в жидкой синтетической среде, содержащей галактозу, при 30°C для дальнейшего анализа.Клоны оказался стабильным после нескольких повторных посевов на чашках с синтетической средой, содержащей галактозу. Стабильный уровень неслитых хромосом 6 также остается неизменным в галактозе (данные не показаны).

Были изучены кариотипы нескольких выживших от Lev1212 ( pGAL1-CEN6-pGAL1 ) и Lev730 [ pGAL1-CEN6-pGAL1 rap1-(Δ) lif1-Δ ]. Неожиданно они обнаруживают нормальную хромосому 6 и две копии хромосомы 2 (данные не показаны).хромосома 2 несет кластер генов GAL7 , GAL10 и GAL1 , продукты которых превращают галактозу в глюкозо-фосфат. GAL2 , кодирующий пермеазу галактозы, находится на другой хромосоме. Введение в Lev1212 и Lev730 дополнительной копии GAL7 , GAL10 и GAL1 на центромерной плазмиде значительно увеличивают частоту выживания на галактозе (данные не показаны).Это говорит о том, что два копии хромосомы 2 придают устойчивость к галактозе за счет увеличения дозы GAL7 , GAL10 и GAL1 , что может, в свою очередь, снизить внутриклеточную концентрацию галактозы и уменьшить скорость транскрипции с промоторов GAL1 , частично восстановление функции CEN6 .

Штаммы Lev1125 и Lev1126 [ loxP-CEN6-loxP rap1-(Δ) ], трансформированные pRS315- pGAL1-CRE , были свежевысеяны штрихами на глюкозосодержащей синтетической среде без лейцина, а затем выращены до насыщения в YPD за 6 дней при 30°С.Клетки распределяли в соответствующем разведении на чашки с синтетической средой, содержащей 2% галактозы, без лейцина. Выжившие однократно пересевали штрихами на чашки с синтетической средой, содержащей галактозу, без лейцина, и проверяли на потерю Ген klTRP1 связан с кассетой loxP-CEN6 на чашках с синтетической средой без триптофана. Затем потерю CEN6 подтверждали с помощью ПЦР с праймерами, окружающими локус CEN6 .Наличие теломер-теломерного слияния у каждого отдельного выжившего cen6-Δ определяли с помощью PFGE (рис. 4D) и Саузерн-блоттинга с XhoI и Y’-зондом (данные не показаны). Слияние оказалось стабильным после нескольких рестриков на Пластины YPD. Стабильный уровень неслитой хромосомы 6 также остается неизменным (данные не показаны).

Клонирование и секвенирование слитых теломер-теломеров

Слияния между теломерами у дрожжей иногда генерировали уникальные сайты рестрикции на стыке (Pardo and Marcand 2005).Слияние клонов III и VIII содержит сайты рестрикции HpyCh5V и RsaI соответственно. Эти слияния были усилены с помощью ПЦР и расщепляли по их стыку, а каждую теломеру субклонировали и секвенировали. Реконструированная последовательность слияния из клона III отображает 147 и 95 п.н. TG 1-3 повторы: GTCAGAAAGCCGGGTAAGGAGTGACAGCGAGAGTAAAGATAGATGTGAAAAGTGTGGGTGTGGTGTGTGGGTGTGTGGGTGTGGGTGTGGGTGTGGGTGTGGTGTGGGTGTGGTGTGGGTGTGTGTGTGTGGGTGTGGTGTGGGTGTGGTGTGGGTGTGGTGTGGGTGTGGGTGTGGTGTGTGTGTGGGTGTGGTG TGCA CCACACCCACACACACACACCCACACACCACACCCACACACCACACCACACACCACACCACACACCACACCACACCCACACACCCACACACACTTTTCACATCTACCTCTACTCTCGCTGTCATACCTTACCCGGCTTTCTGAC.

Реконструированная последовательность слитого из клона VIII дисплеи 159 и 152 п.н. TG 1-3 повторов: GTCAGAAAGCCGGGTAAGGAGTGACAGCGCGAGTAAAGGTAAATGTGAAATGTGTGTGTGTGTGGGTGTGTGGGTGTGGGTGTGGGTGTGGTGTGTGGGTGTGTGGGTGTGGTGTGTGTGGTGTGGGTGTGGTGTGTGGTGTGTGTGGGTGTGGTGTGGTGTGGTGTGTGGGTGTGTGTGGGTGTGGGTGTGGTGTGTGTGGGTGTG GTAC CCACACACCACACCCACACCCACACACCCACACCCACACCCACACCCACACACCACACCCACACCCACACACCACACCCACACACCACACCCACACACCACACCACACACCACACCACACACCACACCACACCCACACACCCACACACACTTTTCACATCTACCTCTACTCTCGCTGTCATACCTTACCCGGCTTTCTGAC.

Праймеры Y’, использованные для амплификации, подчеркнуты. Сайты HpyCh5V и RsaI выделены жирным шрифтом.

ПФГЭ

Дрожжевую ДНК, встроенную в агарозные пробки, готовили следующим образом: около 10 9 клеток дважды промывали 1 мл 50 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис (рН 7,5) (или 1 мл 1% Тритона, 250 мМ ЭДТА, 10 мМ трис при рН 7.5 для клеток, арестованных в G1 или G2/M) (фиг. 5B) и ресуспендированных в 150 мкл 50 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис (pH 7,5). К суспензии добавляли зимолазу (0,6 мкл в концентрации 20 мг/мл). который быстро нагревали до 42°С и смешивали с 250 мкл предварительно нагретого 1% агарозного LMP и 125 мМ ЭДТА. Подвеска была распространена в лунки объемом 80 мкл, помещенные на прохладную поверхность. Пробки экструдировали и инкубировали в течение 24 ч при 37°С в 1,5 мл 500 мМ ЭДТА. и 10 мМ Трис (pH 7.5) с последующим выдерживанием в течение 24 ч при 55°C в 1,25 мл 500 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис (pH 8,0), 1% N-лаурилсаркозила и 0,4 мг/мл протеиназы К. Пробы промывали в течение 1 ч 3 раза в 1 мл 50 мМ ЭДТА и 10 мМ Трис (рН 7,5). Импульсное поле электрофорез проводили в 1% агарозном геле в 0,5× ТВЕ при 14°С на CHEF DRII от Bio-Rad с временем переключения 60 с в течение 15 ч, затем 90 с в течение 9 ч при 200 В.

Саузерн-блот

Зонды для Саузерн-блотов представляли собой продукты ПЦР, амплифицированные из геномной ДНК дрожжей и очищенные в геле.Хромосома Зонд 6 представляет собой фрагмент размером 2,7 т.п.н. из координат 72471–75177 на левом плече хромосомы 6. Зонд Y’ представляет собой фрагмент размером 0,85 т.п.н. от дистального конца элемента Y’ (например, координаты 52–893 хромосомы 8). Зонд TEL 6R представляет собой фрагмент размером 0,6 т.п.н. координаты 268971–269589 хромосомы 6. Зонд хромосомы 3 представляет собой фрагмент размером 2,4 т.п.н. из координат 138842–141231 хромосомы 3. Зонд хромосомы 7 равен 2.Фрагмент размером 3 т.п.н. из координат 14451–16729 хромосомы 7. Зонд хромосомы 5 имеет размер 2,1 т.п.н. фрагмент из координат 113034–115142 хромосомы 5.

Благодарности

Мы благодарим Джули Купер за плодотворные обсуждения этого проекта, а также Офера Рога, Франка Ульманна, Мадалену Тарсунас, Rachel Lescasse, Serge Gangloff, Sylvaine Gasparini, Devanshi Jain и Laure Sabatier за предложения и комментарии.Этот работа поддерживается грантами от ARC и ANR (ANR-06-BLAN-076).

  • Copyright © 2010, Cold Spring Harbour Laboratory Press

Простуда и грипп — Financial District New York, NY: Family Medicine NYC, PC: Family Medicine

Что такое простуда?

Простуда — это вирусная инфекция верхних дыхательных путей (горла и носа).Обычно это безвредно, и большинство людей выздоравливают в течение от недели до 10 дней. Если симптомы не улучшаются, посетите команду Family Medicine NYC, PC для диагностического тестирования, чтобы определить причину ваших симптомов.

симптомы распространенного холода включают в себя:

  • насморк или душливый нос
  • боль в горле
  • кашель
  • пробок
  • легкая головная боль или легкие боли
  • чихание

Вы также можете иметь низкий лихорадка и общее недомогание.

Что такое грипп?

Грипп — это вирусная инфекция. Грипп атакует вашу дыхательную систему и в некоторых случаях может пройти сам по себе. Иногда грипп может быть опасным для жизни и приводить к осложнениям, особенно у людей с ослабленной иммунной системой, пожилых людей и детей младшего возраста.

Люди с хроническими заболеваниями, такими как болезни почек и сердца, астма и диабет, также имеют повышенный риск развития осложнений от гриппа.

Наилучшим профилактическим методом защиты от гриппа является ежегодная вакцинация против гриппа.Ежегодная вакцинация против гриппа рекомендуется для всех в возрасте старше 6 месяцев.

Что вызывает грипп?

Вирусы гриппа распространяются по воздуху, когда инфицированный человек разговаривает, чихает или кашляет. Вы можете заразиться этими микробами, когда дотрагиваетесь до предмета, например клавиатуры компьютера, а затем дотрагиваетесь до своего лица, перенося микробы в рот, нос или глаза. Вы также можете вдыхать капли в воздухе.

Если у вас есть симптомы гриппа, вы обычно заразны.

Каковы симптомы гриппа?

Симптомы гриппа различаются, но могут включать:

  • Заложенность носа и насморк
  • Чихание и боль в горле
  • Стеснение в груди и боль в груди
  • Усталость и боль в мышцах
  • Повышение температуры, озноб 0 температурная чувствительность
  • Головная боль и общая слабость
  • Постоянный кашель

Если у вас есть симптомы простуды или гриппа, лучше обратиться к врачу в Family Medicine NYC, PC для лечения.

Каковы осложнения гриппа?

Если у вас хорошее здоровье, вы сможете побороть грипп в течение нескольких недель без каких-либо длительных последствий. У лиц с повышенным риском могут развиться осложнения, такие как:

  • Бронхит
  • Пневмония
  • Обострения астмы
  • Ушные инфекции
  • Проблемы с сердцем

гидратация и некоторые лекарства, такие как противовирусные препараты, обезболивающие, противозастойные назальные спреи и сиропы от кашля.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.