Неоднородность гипофиза: МРТ — находки

Содержание

МРТ — находки

Мурзаева Ирина Юрьевна

Эндокринолог, Врач превентивной медицины

МРТ (магнитно- резонансная томография) — томографический способ исследования внутренних органов и тканей с использованием физического явления ядерного магнитного резонанса. Это современный безопасный (без ионизирующего излучения) неинвазивный диагностический метод, широко применяемый в медицинской практике, в частности в неврологии и нейрохирургии.

Причём тут эндокринология, спросите вы?

Как раз после исследования МРТ головного мозга, назначенного неврологом, пациенты часто направляются и к эндокринологу.

Но обо всём по порядку.

Головной мозг состоит из нескольких отделов, отвечающих за конкретное действие: зрение, мышление, память, слух, обоняние, движение в пространстве, сон и так далее…. И это не только неврологические функции, но и эндокринные.

Гипофиз – главная эндокринная железа организма, «дирижёр» всем гормональным оркестром, находится в нижней части головного мозга, в костной нише, недалеко от зрительного перекреста. Орган очень маленький, всего 0.7 грамм, но крайне важный.

Именно в гипофизе врачи–специалисты по МРТ часто находят изменения. Гипофиз — орган очень активно работающий (гормоно-продуцирующий), имеющий очень плотное кровоснабжение, поэтому и подвержен воздействиям изнутри и извне.

1. Для начала считается объём гипофиза, он чаще всего немного увеличен, подсчёт объёма гипофиза идёт по формуле = (длина*ширина*поперечник)*3.14\6. В норме объём гипофиза- 0.2 мл-0.41 мл.

Уменьшение размера органа встречается намного реже, чем его увеличение. Например, изменение по типу «синдрома пустого турецкого седла» — чаще бывает у пациентов после травм, при частых головных болях и перепаде внутричерепного давления. Гипофиз сохранен, но он сдавливается спинно-мозговой жидкостью и становится похож по форме на полумесяц шириной 1-2 мм, функция его может быть или сохранена или нарушена.

Размер может быть уменьшен после операции на гипофизе, такие тоже бывают, например после удаления соматотропиномы – опухоли, вырабатывающей очень много гормона роста. Гипоплазия (уменьшение гипофиза) встречается при врожденном дефиците гормона роста и низкорослости.

2. Далее оценивается однородность ткани и наличие объёмных образований:

ткань гипофиза может быть диффузно-неоднородная, может иметь точечные кровоизлияния, содержать кисту или аденому. Каждый такой случай оценивается индивидуально.

Наиболее распространены в таких МРТ находках — аденомы (гормонально-активные образования) или инцеденталомы (гормонально-неактивные образования), что это — аденома или инцеденталома, выясняется после гормонального обследования.

Эти опухоли всегда доброкачественные!!!. Конечно, важны размеры опухоли: микро- или макроаденома. От этого будет зависеть лечебная тактика. Мироаденома — размерами до 1 см, макро- более 1 см , гигантская аденома — более 3 см.

3. По характеру выработки гормона опухоль может быть: пролактинома (вещество – пролактин), соматотропинома (гормон роста), кортикотропинома (АКТГ-адренокортикотропный гормон) — болезнь Кушинга, опухоли, вырабатывающие главные половые гормоны ФСГ и ЛГ практически не встречаются, тиротропинома (опухоль, вырабатывающая ТТГ и действующая на щитовидную железу, также встречается крайне редко).

Поэтому для уточнения характера гормонопродукции сдают анализ на: ТТГ, Т4св, Т3св, АКТГ, кортизол, пролактин, ФСГ, ЛГ, ИФР1 и гормон роста (ГР).

4. В зависимости от типа продукции гормона опухолью будут и клинические проявления заболевания, но на этом не будем останавливаться. Скажу лишь, так как наиболее уязвимым отделом гипофиза является зона, отвечающая за выработку главных половых гормонов – ФСГ и ЛГ, и опухоль чаще «сдавливает» эту зону, появляются симптомы нарушения половой функции, у женщин это выявить проще — это нарушение менструального цикла.

5. МРТ обычно делают с контрастом , так чётче можно увидеть зону поражения.

6. По характеру роста аденомы выделяют:

супраселлярный рост – в строну зрительного нерва, наиболее опасный рост с риском нарушения зрения, и рост в сторону третьего желудочка – вызывая нарушение оттока спинно-мозговой жидкости, чаще это кортикотропиномы и гормонально-неактивные опухоли.

Параселлярный рост – в сторону височных долей, со сдавлением черепно-мозговых нервов, чаще это пролактиномы и соматоторпиномы. Инфраселлярный рост — в пазуху носа, достаточно безопасный рост. Ретроселярный рост – через спинку турецкого седла (костный выступ позади гипофиза), в сторону ствола мозга с соответствующими проявлениями. Антеселлярный рост – в сторону носовых ходов, встречает редко, только при очень больших аденомах.

Лечение аденом без и с гормонопродукцией может быть как медикаментозное, так и хирургическое, иногда, реже, лучевое лечение, часто – просто наблюдение без серьёзного вмешательства.

7. Если при исследовании МРТ нет явных данных за аденому, её можно предположить по косвенным признакам, указывающим на развитие аденомы (особенно если МРТ сделано без контраста или вместо МРТ сделан рентген черепа). Это «выбухание верхнего контура гипофиза», «деформация дна турецкого седла», «отклонение воронки гипофиза вправо или влево».

8. Теперь немного об особенностях разных аденом: пролактиномы чаще не имеют кист внутри опухоли и размерами по типу микроаденом, соматотропиномы чаще имеют резко сниженный сигнал плотности опухоли и большие размеры (макроаденомы), гигантские аденомы чаще гормонально-неактивны.

9. Другой вид часто встречающихся опухолей головного мозга – краниофарингиомы. Медленно-растущая опухоль из «остатков эмбриональной ткани»), они не вырабатывают гормоны, но сдавливают «нейрональные пути» от гипоталамуса к гипофизу, чаще встречаются у детей и тем самым вызывают нарушение роста, замедляется рост ребёнка в длину. У взрослых вызывают гипотиреоз, несахарный диабет, нарушение менструаций, нарушение потенции у мужчин, ожирение.

Пик заболевания 6-16 лет.

10. Гамартома гипоталамуса – редкая опухоль, выявляемая при таком эндокринном заболевании как преждевременное половое развитие у детей(ППР). Гамартомы чаще небольшие 3-15 мм. На окружающие ткани не действует. Кроме признаков ППР (рост молочных желез, лобкового оволосения в возрасте до 6-7 лет, иногда кровомазанья), гамартому часто сопровождают неврологические проявления: эпилептические припадки смеха, судороги, расстройства мышления, памяти и усидчивости, эмоциональные расстройства — дефицит внимания, аутизм, синдром Аспергера, депрессия, у некоторых детей может быть неконтролируемая агрессия.

11. Киста шишковидной железы (эпифиза). Шишковидная железа — это зона головного мозга, вырабатывающая гормон мелатонин. Развивается киста из-за закупорки выводящего клапана железы, вследствие чего секрет железы не выводится, а скапливается внутри кистозного образования. При поражении железы чаще симптомов нет, но в некоторых случаях могут возникать: нарушение сна, упорная головная боль, нарушение зрения, ухудшение координации движений, тошнота и рвота.

12. Картину диффузной неоднородности гипофиза могут вызывать такие системные патологии как: гистиоцитоз Х(эозинофильная гранулёма), саркоидоз (ретикуло-эндотелиоз) – вызывающие инфильтрацию ткани гипофиза поражающими элементами, чаще с развитием недостаточности гипофиза по типу несахарного диабета, вторичного гипотиреоза.

Несмотря на всю серьёзность описанных случаев, можно сказать, что встречаются эти образования нечасто, а если и появляются, то чаще гормонально неактивны, растут медленно, и являются лишь показанием к клиническому наблюдению за состоянием здоровья.

Гипофиз: размер имеет значение — БУЗ ВО Медсанчасть «Северсталь

Зачастую после исследования МРТ (магнитно-резонансная томография) головного мозга, назначенного неврологом, пациенты направляются к эндокринологу. В каких случаях это бывает, по каким причинам, какова цель направления? Дело в том, что врачи, специалисты по МРТ, находят изменения в гипофизе.

«Дирижер» гормонального оркестра

Головной мозг состоит из нескольких отделов, отвечающих за конкретные функции: зрение, мышление, память, слух, обоняние, движение в пространстве, сон и так далее. И это не только неврологические функции, но и эндокринные.

Гипофиз – главная эндокринная железа организма, «дирижер» всего гормонального оркестра – находится в нижней части головного мозга, в костной нише, недалеко от зрительного перекреста. Орган очень маленький, весом всего 0,7 г, но крайне важный. В переводе с латинского языка «гипофиз» означает «отросток».

Первое описание строения гипофиза сделано в 1867 году П.И. Перемежко. В дальнейшем проводится множество различных исследований по изучению анатомии и физиологии гипофиза, выделения из него гормонов. Упоминается гипофиз и в мировой художественной литературе, достаточно вспомнить бессмертное творение Михаила Булгакова «Собачье сердце».

Анатомически гипофиз состоит из трех долей: передней (аденогипофиз), задней (нейрогипофиз) и промежуточной. Гипофиз вырабатывает множество различных гормонов, необходимых для нормального функционирования человеческого организма. Это тиреотропный, адренокортикотропный, гонадотропный, соматотропный, пролактин, вазопрессин, окситоцин, а также меланоцитостимулирующие гормоны.

Причины уменьшения

Гипофиз – очень активно работающий орган (гормонопродуцирующий), имеет очень плотное кровоснабжение, поэтому и подвержен воздействиям изнутри и извне. В норме объем гипофиза 0,2–0,41 мл. Уменьшение размера органа встречается намного реже, чем его увеличение. Например, изменение по типу синдрома «пустого турецкого седла» чаще бывает у пациентов после травм, при частых головных болях и перепаде внутричерепного давления. Гипофиз сохранен, но он сдавливается спинномозговой жидкостью и по форме становится похож на полумесяц шириной 1-2 мм, функция его может быть или сохранена, или нарушена.

Размер может быть уменьшен после операции на гипофизе, такие тоже бывают, например, после удаления соматотропиномы – опухоли, вырабатывающей очень много гормона роста. Гипоплазия (уменьшение гипофиза) встречается при врожденном дефиците гормона роста и низкорослости.

Далее оценивается однородность ткани и наличие объемных образований: ткань гипофиза может быть диффузно-неоднородная, может иметь точечные кровоизлияния, содержать кисту или аденому. Каждый такой случай оценивается индивидуально.

Наиболее распространены среди таких МРТ-находок аденомы (гормонально-активные образования) или инциденталомы (гормонально-неактивные образования).

Вид образования выясняется после гормонального обследования. Эти опухоли всегда доброкачественные. Конечно, важны размеры: микро- или макроаденома. Это определит лечебную тактику. Микроаденома имеет размер до 1 см, макроаденома – более 1 см, гигантская аденома – более 3 см.

Уязвимая зона

По характеру вырабатываемого гормона опухоли делят на следующие виды: пролактинома (выделяет пролактин), соматотропинома (гормон роста), кортикотропинома (продуцирует АКТГ – адренокортикотропный гормон, вызывает болезнь Кушинга), опухоли, вырабатывающие главные половые гормоны – ФСГ и ЛГ (практически не встречаются), тиреотропинома (вырабатывает ТТГ и действует на щитовидную железу, также встречается крайне редко).

Поэтому для уточнения характера гормонопродукции пациенты сдают анализ на ТТГ, Т4св, Т3св, АКТГ, кортизол, пролактин, ФСГ, ЛГ, ИФР1 и гормон роста (ГР).

От типа продуцируемого опухолью гормона зависят клинические проявления заболевания, но на этом не будем останавливаться. Скажу лишь: так как наиболее уязвимым отделом гипофиза является зона, отвечающая за выработку главных половых гормонов (ФСГ и ЛГ), и опухоль чаще сдавливает эту зону, появляются симптомы нарушения половой функции. У женщин это выявить проще, поскольку происходит нарушение менструального цикла.

МРТ обычно делают с контрастом, так четче можно увидеть зону поражения.

Вектор роста

По характеру роста аденомы делят на такие виды:

супр

  • аселлярные – рост в сторону зрительного нерва, наиболее опасный рост с риском нарушения зрения, и рост в сторону третьего желудочка, что вызывает нарушение оттока спинномозговой жидкости, чаще это кортикотропиномы и гормонально-неактивные опухоли;
  • параселлярные – рост в сторону височных долей со сдавлением черепно-мозговых нервов, чаще это пролактиномы и соматотропиномы;
  • инфраселлярные – рост происходит в пазуху носа, достаточно безопасный рост;
  • ретроселлярные – рост через спинку турецкого седла (костный выступ позади гипофиза) в сторону ствола мозга с соответствующими проявлениями;
  • антеселлярные – рост в сторону носовых ходов, встречается редко, только при очень больших аденомах.
Лечение аденом без гормонопродукции и с гормонопродукцией может быть, как медикаментозное, так и хирургическое, реже применяется лучевое лечение, часто просто ведется наблюдение без серьезного вмешательства.

Разные аденомы имеют свои особенности. Пролактиномы чаще не имеют кист внутри опухоли и имеют размер по типу микроаденом. Соматотропиномы чаще имеют резко сниженный сигнал плотности опухоли и большие размеры (макроаденомы). Гигантские аденомы чаще гормонально-неактивны.

Другие виды опухолей головного мозга

Краниофарингиомы – вид часто встречающихся опухолей головного мозга. Медленно растущая опухоль, развивающаяся из остатков эмбриональной ткани. Она не вырабатывает гормоны, но сдавливает «нейрональные пути» от гипоталамуса к гипофизу. Чаще встречается у детей и вызывает нарушение роста. У взрослых вызывает гипотиреоз, несахарный диабет, нарушение менструаций, нарушение потенции у мужчин, ожирение. Пик заболевания – 6–16 лет.

Гамартома гипоталамуса – редкая опухоль, выявляемая при таком эндокринном заболевании, как преждевременное половое развитие у детей (ППР).

Гамартомы чаще небольшие – 3–15 мм. На окружающие ткани не действуют. Кроме признаков ППР (роста молочных желез, лобкового оволосения в возрасте до 6-7 лет, иногда кровомазанья), гамартому часто сопровождают неврологические проявления: эпилептические припадки смеха, судороги, расстройства мышления, памяти и усидчивости, эмоциональные расстройства – дефицит внимания, аутизм, синдром Аспергера, депрессия, у некоторых детей может быть неконтролируемая агрессия.

Киста шишковидной железы (эпифиза). Шишковидная железа – это зона головного мозга, вырабатывающая гормон мелатонин. Развивается киста из-за закупорки выводящего клапана железы, вследствие чего секрет железы не выводится, а скапливается внутри кистозного образования. При поражении железы чаще симптомов нет, но в некоторых случаях могут возникать нарушение сна, упорная головная боль, нарушение зрения, ухудшение координации движений, тошнота и рвота.

Несмотря на всю серьезность описанных случаев, можно сказать, что встречаются эти образования нечасто, а если и бывают, то чаще гормонально-неактивны, растут медленно, являются лишь показанием к клиническому наблюдению за состоянием здоровья.

В настоящее время метод магнитно-резонансной томографии непрерывно совершенствуется, еще больше улучшаются его диагностические возможности.

Лебедев Андрей Сергеевич, врач-рентгенолог высшей квалификационной категории

Структукрная неоднородность аденогипофиза — Вопрос нейрохирургу

Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.

Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 74 направлениям: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского онколога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, липидолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, подолога, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.

Мы отвечаем на 96.57% вопросов.

Оставайтесь с нами и будьте здоровы!

МРТ гипофиза в Ессентуках, магнитно-резонансная томография гипофиза

МРТ гипофиза – это один из основных современных способов диагностики и обнаружения опухолей в районе турецкого седла. Метод обеспечивает высокую информативность и чёткость полученного результата, если сравнить с КТ.

Аденомы гипофиза составляют от всех опухолевых образований головного мозга около 15%. Аденома гипофиза представляет собой доброкачественный тип опухоли в переднем отсеке железы (в аденогипофизе). Намного реже здесь выявляются злокачественные опухоли, которые представлены аденокарциномами.

Стоимость МРТ

Цена Цена по акции
МРТ головного мозга
МРТ головного мозга обзорная 3100 2600
МРТ гипофиза 3100 2600
МРТ орбит 3100 2600
МРТ придаточных пазух 3100 2600

Показания к исследованию гипофиза с помощью метода МРТ есть при наличии таких симптомов, как:

  • стремительное снижение остроты или чёткости зрения, повышенное внутриглазное давление;
  • постоянный или регулярный характер головной боли;
  • сужение полей зрения;
  • проблемы с эндокринной системой;
  • нарушение движений глаз, двоение в глазах.

МРТ гипофиза даёт возможность чётко определить даже расположение опухоли в районе турецкого седла, помогает врачу выяснить наличие влияния опухоли на волокна зрительного нерва, одну из сторон хиазмы и окружающие их ткани. МРТ обнаруживает, в том числе, и крошечные микроаденомы, определяя их структурные особенности, форму, локализацию.

При подозрении образования на злокачественность проводится МРТ с контрастированием области гипофиза.

Признаки, характерные для аденокарцином гипофиза:

  • нечёткость границ опухоли в пределах окружающих тканей;
  • неоднородность и различная интенсивность структуры;
  • неправильные формы образования.

Смотреть полный прайс-лист

Диффузно-неоднородная структура гипофиза, причины и признаки структурных проблем питуитарной железы

Сбои в нейроэндокринном комплексе приводят к проблемам в работе внутренних систем организма. Диффузно-неоднородная структура гипофиза – это клиническое проявление нарушений, отражающееся на тканях железы.


Гипофиз имеет небольшие размеры и массу, составляющую всего 0,5-1 гр. Чтобы определить любые отклонения, требуется проведение УЗИ или томографии. Результаты обследования могут указать, что структура гипофиза при исследовании диффузно-неоднородная. Что означает этот диагноз?

Почему гипофиз имеет неоднородную структуру


Диагноз диффузная неоднородность ткани, указывает на неодинаковые отражающие свойства тканей. Причиной этого являются:
  • Аденомы .
  • Кистозные образования .
  • Опухоли.

Следовательно, структурная неоднородность гипофиза значит, что в некоторых участках ткань имеет уплотнения. В большинстве случаев речь идет о доброкачественном образовании. Но при отсутствии должного лечения, возможно перерождение тканей и образование аденокарциномы, злокачественной опухоли. Происходит это крайне редко, но опасность перерождения все же существует.

Признаки неоднородной структуры питуитарной железы


Мелкоочаговая неоднородность, зачастую не проявляется. Симптоматика заболевания появляется при тенденции к увеличению опухоли. Признаки указывают на локализацию уплотнения.

Основными симптомами заболевания являются:
  • Резкое ухудшение зрения – сначала уменьшается поле видимости. При посещении офтальмолога обнаруживается ухудшение моторики глазного яблока.
  • Головные боли – не снимаются обычными анальгетиками.
  • Неврологические признаки – опухоль больших размеров приводит к появлению судорог, онемения, эпилептических припадков.
  • Изменения гормонального фона – последствием неоднородности ткани питуитарной железы является половая дисфункция, нарушения менструального цикла, неспособность забеременеть.

Дополнительными признаками, указывающими, что присутствует неоднородность гипофиза, является нарушение суточных ритмов человека, бессонница, в тяжелых случаях, потеря ориентации в пространстве.

Чем страшна диффузная неоднородность


Неоднородная структура питуитарной железы говорит о том, что в области гипофиза развивается опухолевое новообразование. Последствия развития возникшей аномалии зависят от ее природы, объема и степени злокачественности.

При небольших размерах образования, диффузная неоднородность практически не причиняет беспокойств пациенту. Симптоматические проявления, если и наблюдаются, носят кратковременный характер.

Результатом дальнейшего увеличения опухоли являются:
  • Нарушения в гормональном фоне человека.
  • Дисфункция половой и репродуктивной системы.
  • Ухудшение зрительной функции, вплоть до частичной или полной утраты зрения.
  • Неврологические проявления: эпилептические приступы, нарушение координации, парализация конечностей, головокружения.

Причиной неоднородности структуры нижнего мозгового придатка может являться быстро растущее злокачественное новообразование. В таком случае, заболевание пациента имеет неблагоприятный прогноз.

Диффузно-неоднородные изменения в структуре гипофиза особенно сильно отражается на половой системе человека. У женщин патология проявляется в сбое менструального цикла, невозможности забеременеть. Мужчины страдают от лишнего веса, эректильной дисфункции.

В детском возрасте диффузно-неоднородная структура связанна с карликовостью и гигантизмом.


Признаки диффузной неоднородности структуры гипофиза начинают проявляться, когда образование становится объемным и начинает воздействовать на окружающие ткани. Наличие аномалии в большинстве случаев диагностируется случайно.

Чтобы назначить оптимальный курс лечения неоднородности, лечащий врач выполнит сбор анамнеза, а также порекомендует пройти обследование с помощью томографа.

Какие обследования нужно сделать


Неврологические симптомы и другие проявления не дают возможности точно установить наличие диффузной неоднородности тканей питуитарной железы.

Чтобы исключить другие факторы, назначается несколько видов диагностических процедур:
  • Магнитно-резонансная томография – на сегодняшний день МРТ картина является наиболее информативной.
    Точность диагностики настолько велика, что позволяет увидеть новообразования и уплотнения с объемом всего несколько миллиметров. На МРТ, структура гипофиза показана в виде объемного изображения, что позволяет увидеть любые изменения и тенденции к развитию.
    Если есть вероятность развития онкологического заболевания, проводится исследование с использованием маркера. МРТ гипофиза с контрастом помогает выявить природу опухолевого образования.
  • УЗИ – проводится при невозможности выполнить томографию. Особенно часто ультразвуковая диагностика используется при обследовании новорожденных детей.

По результатам исследования становится ясным наличие или отсутствие опухолевого образования. При небольшом объеме последнего, назначается постоянный контроль над ростом опухоли.

Отсутствие тенденций к увеличению является показанием к постоянному мониторингу отклонений, медикаментозное лечение не требуется.

Если ткань гипофиза имеет неоднородный сигнал, по причине гормонально активного образования, назначается блокирующая терапия. Медицинские препараты будут тормозить производство пролактина или гормона роста.

Решение о назначении медикаментозного лечения принимает лечащий врач. При должной и квалифицированной терапии, возможно устранить последствия нарушений: восстановить репродуктивные способности женщины и вернуть потенцию мужчине.

С помощью профилактического и консервативного лечения можно остановить рост опухоли и нормализовать гормональный фон человека.

Материалы: http://ponchikov.net/health/zabolevaniya-mozga/554-diffuzno-neodnorodnaya-struktura-gipofiza.html

РОССИЙСКОЕ ОБЩЕСТВО АНГИОЛОГОВ И СОСУДИСТЫХ ХИРУРГОВ

Объявление

Уважаемые коллеги! Просим вас отправлять отчеты о работе сосудистых отделений РФ за 2020 год через личный кабинет на сайте.

Объявление

Глубокоуважаемые коллеги! В соответствии с решением Президиума Российского общества ангиологов и сосудистых хирургов от 18.12.2021 года научные статьи, посвящённые хирургии клапанов сердца, в журнале «Ангиология и сосудистая хирургия» с 2022 года публиковаться не будут.

Объявление

Уважаемые коллеги!

В связи с передачей журнала в издательство «ГЭОТАР-Медиа» произошло сокращение штата редакции журнала «Ангиология и сосудистая хирургия». Портфель с редакционными материалами не был передан в РОАиСХ.

Просьба авторов, присылавших статьи в 2020-2021 годах, продублировать материалы на новый электронный адрес: [email protected], если работа еще не была опубликована в журнале.

Благодарим за понимание!

Объявление

Уважаемые коллеги!

Информируем вас о запуске официального канала Российского Общества ангиологов и сосудистых хирургов в Телеграме.

Ждём вас на нашей новой информационной площадке!

Объявление

Уважаемые коллеги, кафедра ангиологии, сердечно-сосудистой, эндоваскулярной хирургии и аритмологии РМАНПО МЗ РФ приглашает принять участие в циклах повышения квалификации по специальностям сердечно-сосудистая хирургия, рентгенэндоваскулярные диагностика и лечение, кардиология.

Подробности на сайте: rmapo.ru.

Объявление

Уважаемые коллеги!

Обращаем ваше внимание, что статьи для размещения в журнале «Ангиология и сосудистая хирургия» необходимо направлять на новый электронный адрес: .

Если ваша статья не была опубликована или по ней не была получена обратная связь, просим вас повторно направить статью на указанный выше электронный адрес.

С уважением, РОАиСХ

Объявление

Уважаемые коллеги! Вышла книга «Хирургия почечных артерий» под редакцией академика РАН А.Ш. Ревишвили, академика РАН А.В. Покровского, члена-корреспондента РАН А.Е. Зотикова.

Желающие могут приобрести книгу по адресу:
Фонд «Русские Витязи»
125009, Москва, Нижний Кисловский переулок, д.6, стр.1
Тел.: +7(495) 690-32-81, 690-27-98
E-mail:
Сайт: русские-витязи.рф, aerospaceproject.ru

УЗИ простаты (ТРУЗИ предстательной железы): цена, показания, подготовка

УЗИ предстательной железы позволяет определить патологии данного органа, которые могут стать причиной возникновения простатита, аденомы простаты, онкологии. Хронические заболевания предстательной железы часто приводят к эректильной дисфункции и мужскому бесплодию. Показания к проведению УЗИ простаты определяет уролог-андролог

Предстательная железа или простата вырабатывает секрет, составляющий около половины всего объема спермы, держит в норме уровень половых гормонов и гормонов гипофиза.
Длительные воспалительные процессы в простате отрицательно влияют на сперматозоиды – они становятся малоподвижными, сокращается их количество, у них появляются морфологические дефекты. При этом в сперме могут появляться лейкоциты (белые кровяные клетки), что снижает её оплодотворяющую способность (пиоспермия). Также могут зарубцеваться семявыводящие пути, что станет препятствием для выхода сперматозоидов в семенную жидкость.

УЗИ предстательной железы назначают при следующих симптомах:
— нарушение мочеиспускания.
— боль в тазовой области;
— боль при семяизвержении;
— чувство тяжести в прямой кишке;
— неполное опорожнение мочевого пузыря;
— ослабление эрекции.
Обследование показано всем мужчинам старше 40 лет для своевременного выявления патологий простаты и профилактики рака.
Ультразвуковое исследование предстательной железы даёт возможность обнаружить:
— простатит;
— повреждения мочевого пузыря;
— нарушения мочеиспускания;
— доброкачественную гиперплазию предстательной железы;
рак простаты;
— эректильную дисфункцию.
В процессе УЗИ с большой точностью определяются размер простаты, её форма, плотность, эхогенность, особенности кровоснабжения, а также выявляются патологические изменения — наличие камней в просвете, их состав, изменение структуры тканей, присутствие новообразований, разрастание железистой ткани, воспалительные процессы, аденома с узловыми образованиями.

Патологиям предстательной железы соответствуют следующие расшифровки УЗИ:
— аденома – сильное изменение размеров органа, наличие включений до 7 мм;
— хронический простатит – повышенная эхогенность,
— воспаление – пониженная эхогенность;
— новообразования — наблюдается отсутствие четкости контуров, увеличение лимфоузлов;
— киста, камни — определяются как участки с гипоэхогенностью.

По результатам ультразвукового обследования простаты составляется протокол с указанием всех параметров, даются характеристики близлежащих органов малого таза, делаются снимки. Данные УЗИ совместно с результатами лабораторных анализов, спермограммы, осмотра и анамнеза, позволяют урологу поставить правильный диагноз и назначить соответствующее лечение.

Подготовка к УЗИ предстательной железы имеет важное значение для получения точных результатов. Подготовительные мероприятия зависят от способа, которым будет проводиться исследование:
1) через стенку прямой кишки (трансректальное исследование или ТРУЗИ)
2) через брюшную стенку

ТРУЗИ является более информативным методом. Подготовка к нему, прежде всего, направлена на очищение кишечника и предупреждение в нём процесса газообразования. Исследование проводится при наполненном мочевом пузыре.

Неоднородность адренокортикотропина в гипофизе и плазме в перинатальном периоде

Три иммунореактивные формы АКТГ характеризуются своей кажущейся молекулярной массой (ММ) и биологической активностью при гель-фильтрации кислых экстрактов передней или нейропромежуточной доли гипофиза плода и новорожденной крысы на тонкой колонке с сефадексом G50. «Большая» форма АКТГ, кажущаяся молекулярная масса которой близка к 44 000, почти не стимулирует высвобождение кортикостерона in vitro перифузированными надпочечниками плода.Напротив, «промежуточные» (ММ: соответствует 13 000) и «малые» (ММ: соответствует 4 500) формы проявляют высокую биологическую активность, вызывая секрецию кортикостерона, которая зависит от логарифмической дозы. В перинатальный период относительные пропорции между этими различными молекулярными формами АКТГ изменяются как в передней, так и в нейропромежуточной долях. «Большой» АКТГ является основной формой в нейропромежуточной доле гипофиза плода крысы. После рождения соотношение «большой» АКТГ/общий АКТГ регулярно снижается до 4-й недели после родов; это не сильно отличается от такового у беременных взрослых самок.Три иммунореактивные формы АКТГ присутствуют в передней доле на протяжении всего перинатального периода. Постепенное увеличение «средней» и «малой» форм сопровождается соответствующим уменьшением «большой» формы. Передние доли 17-, 19- и 21-дневных плодов, стимулированные in vitro кислым экстрактом взрослого гипоталамуса, высвобождают три иммунореактивные формы АКТГ в тех же пропорциях, что и в соответствующих экстрактах передних долей. На 17, 19 и 21 день беременности плазма плода содержит все иммунореактивные формы АКТГ, ранее наблюдаемые в гипофизе.Доля «малой» формы АКТГ постепенно увеличивается, тогда как доля «большой» формы уменьшается по мере развития беременности. В срок относительная доля «малого» АКТГ в плазме выше, чем в гипофизе плода. Контролируемое переваривание трипсином гипофизарного «большого» АКТГ приводит к превращению его в «промежуточную» и «малую» иммунореактивные формы. Когда «промежуточный» АКТГ подвергается расщеплению трипсином в тех же условиях, наблюдается постоянная потеря иммунореактивности, но не изменение гормональной формы.Эти данные подтверждают гипотезу о том, что «большой» АКТГ является предшественником «промежуточного» и «малого» АКТГ; напротив, «промежуточная» форма не является предшественником «маленькой». Высокомолекулярная форма АКТГ может эндогенно преобразовываться в формы с более низкой молекулярной массой в кровотоке плода в срок, а также у новорожденных. В плазме плода уровни иммунореактивного АКТГ достигают пиковых значений на 19-й день беременности и затем снижаются до 21-го дня.

Анализ гетерогенности протеомов при клинически нефункциональных аденомах гипофиза | BMC Medical Genomics

2DGE-паттерн и профиль DEP каждого подтипа NFPA по сравнению с контрольным гипофизом

Сравнительная протеомика на основе 2DGE использовалась для анализа вариаций протеома в контрольной группе (n = 8; от 3 до 5 гелевых изображений на образец) по сравнению с каждым типом NFPA , включая NF- (n = 3; 3 изображения геля на образец), LH- (n = 3; 3 изображения геля на образец), FSH- (n = 3; 3 изображения геля на образец) и LH/FSH- ( n = 3; 3 гелевых изображения на образец) ткани аденомы.Каждый образец подвергался 2DGE-анализу от трех до пяти раз для получения трехкратного высококачественного изображения геля 2DGE для каждого образца. На рис. 1 показано оцифрованное эталонное двухмерное изображение геля. ок. 1000 белковых пятен были обнаружены на каждом изображении геля с помощью анализа 2D-изображения геля PDQuest с высоким разрешением, высокой пространственной воспроизводимостью в направлениях IEF и SDS-PAGE, а также высокой воспроизводимостью для трехкратных 2D-изображений геля каждого образца. Белковые пятна 2DGE в основном распределены в пределах pH 4–9 и относительной массы (M r ) 15–150 кДа.Для каждого образца средний процент соответствия между гелями варьировался от 85% до 99% для контрольных гипофизов и от 81% до 90% для NFPA; позиционное отклонение совпадающих пятен среди трех повторов 2D-изображений геля составило 2,13 ± 0,79 мм в направлении IEF и 1,82 ± 0,68 мм в направлении SDS-PAGE; а коэффициент корреляции (r) нормированных объемов пятен для совпадающих между гелями пятен составлял  > 0,76 в диапазоне 0,76–0,92. Высокая пространственная воспроизводимость и количественная воспроизводимость являются результатом одних и тех же экспериментальных условий, поддерживаемых для каждого анализа образцов, включая подготовку образцов, IEF, SDS-PAGE, визуализацию, оцифровку геля и анализ изображений.Эта воспроизводимость обеспечила точное сравнение между каждым подтипом NFPA и контролями.

Рисунок 1

Эталонная карта двумерного гель-электрофореза из контрольного протеома гипофиза человека, помеченного 72 дифференциальными точками среди различных подтипов NFPA (NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-). Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) проводили с помощью полоски IPG длиной 18 см (pH 3–10 NL) и вертикального SDS-PAGE с 12% полиакриламидным гелем.

Всего было определено 93 дифференциальных белковых пятна при сравнении каждого подтипа NFPA (NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-) по сравнению с контрольным гипофизом с пороговым значением более чем в 3 раза и статистически достоверное различие (p < 0.001). На рисунке 2 показано репрезентативное пятно DEP (Spot-1311) среди различных подтипов NFPA (n = 9 изображений геля для каждого типа NFPA) по сравнению с контролем (n = 30 изображений геля) (рисунок 2A) и количественное сравнение нормализованных пятен- объемы между каждым подтипом NFPA по сравнению с контролем (p < 0,001) (рис. 2B). Каждое дифференциальное белковое пятно было помечено на изображении эталонного геля (рис. 1). Каждое дифференциальное белковое пятно вырезали, а белки подвергали расщеплению в геле трипсином с последующим анализом МС, включая MALDI-TOF PMF и LC-ESI-MS/MS.В общей сложности 72 пятна дифференциального белка, которые содержали DEP, были идентифицированы с помощью МС из этих 93 пятен дифференциального белка. Четыре пятна (SSP № 1017, 1103, 2310 и 2419 в таблице 1 и на рисунке 3) из 72 пятен, идентифицированных с помощью МС, содержали два белка; следовательно, 72 пятна представляют 76 белковых пятен. Среди этих 76 белковых пятен 59 DEP (44 подавленных и 15 активированных) были идентифицированы в NF-NFPA по сравнению с контролем, 65 DEP (45 подавленных и 20 активированных) в LH-NFPA, 63 DEP (43 подавленных и 20 активированных) в FSH-NFPA и 55 DEP (41 с пониженной экспрессией и 14 с повышенной экспрессией) в LH/FSH-NFPA.Эти DEP сведены в таблицу 1, которая содержит номер SSP, соответствующий номеру, указанному на рисунке 1, название белка, инвентарный номер Swiss-Prot и значение кратности для каждого подтипа NFPA по сравнению с контролями.

Рисунок 2

Репрезентативное дифференциальное пятно среди различных подтипов NFPA по сравнению с контрольным гипофизом (Spot-1311). Контрольные средства контроля гипофиза; LH означает LH-положительный NFPA; FSH означает FSH-положительный NFPA; ЛГ/ФСГ означает ЛГ/ФСГ-положительный NFPA; и NF означает NFPA с отрицательной экспрессией гормона.Между каждым типом NFPA и контрольным гипофизом существовала статистически значимая разница (p < 0,001). A. Изображения 2DGE (Spot-1311) среди четырех подтипов NFPA. B. Нормализованный спот-объем (Spot-1311) среди четырех подтипов NFPA.

Таблица 1 Дифференциально экспрессируемые белки в различных подтипах клинически нефункциональных аденом гипофиза по сравнению с контролем Рисунок 3

Перекрывающийся анализ дифференциально экспрессируемых белков четырех подтипов NFPA (NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-). Каждое число на этом рисунке соответствует номеру SSP в таблице 1. Те ​​дублированные номера SSP в таблице 1 перемаркированы на этом рисунке следующим образом: 1017(1) = Цепь 1, соматотропин; 1017(2) = Сплайсинг изоформы 2 предшественника соматотропина; 1103(1) = Предшественник соматотропина; 1103(2) = Предшественник варианта гормона роста; 2310(1) = бета-субъединица белка, покрывающего F-актин; 2310(2) = Сплайсинг изоформы 2 бета-субъединицы белка, покрывающего F-актин; 2419(1) = Гуаниновый нуклеоидсвязывающий белок G(O), альфа-субъединица 1; и 2419(2) = белок G(O), связывающий гуаниновые нуклеотиды, альфа-субъединица 2.Номер красного цвета относится к активируемому белку. Номер черного цвета относится к белку с пониженной регуляцией. Метка (*) означает, что эти DEP-пятна являются общими только для двух групп LH- и FSH-NFPA, но не для NF-NFPA.

Сравнительный анализ профилей DEP, полученных для четырех подтипов NFPA, по сравнению с контролем

Перекрывающийся анализ (рис. 3) среди 59 DEP в NF-NFPA, 65 DEP в LH-NFPA, 63 DEP в FSH-NFPA и 55 DEP в LH/FSH-NFPA по сравнению с контролем (таблица 1) показало, что 44 DEP были общими для четырех подтипов NFPA (NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-).Эти 44 общих DEP-пятна среди четырех подтипов NFPA (NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-) включают десять активируемых и 34 депрессивных DEP. Эти десять распространенных DEP с повышенной реакцией представляли собой бета-единицу F-актинового кэпирующего белка, сплайс-изоформу 2 бета-единицы F-актинового кэпирующего белка, белок цинковых пальцев 266, альфа-субъединицу 1 G(O)-белка, альфа-субъединицу 2 G(O)-белка. , альдозоредуктаза, триптофан-5-гидроксилаза, глутатион-S-трансфераза Mu-2, изоцитратдегидрогеназа [НАДФ] цитоплазматическая и пероксисомальная ацил-коэнзим А-тиоэфиргидролаза 2А.34 распространенных DEP со сниженной экспрессией: цепь 1 соматотропина, изоформа сплайсинга 2 предшественника соматотропина, предшественник варианта гормона роста, цепь 1 пролактина, изоформа сплайсинга IL15-S21AA предшественника интерлейкина-15, легкая цепь фактора X, цитокератин 16, альфа-кристаллический C цепь, тау-белок 14-3-3, секретагогин, гомолог Mu-кристаллина, цепь 1 MIMECAN, тканевая трансглутаминаза, АТФ-связывающий белок, ассоциированный с клеточной дифференцировкой, субъединица N6-аденозин-метилтрансферазы 70 кДа, вариант единицы бета-гемоглобина, бета-2 гемоглобина цепь и связывание инсулиноподобного фактора роста.Среди них 16 распространенных ДЭП-пятен содержали соматотропин и его изоформы с разными p I и M r . , а четыре распространенных ДЭП содержали пролактин и его изоформы с разными p I и M r . Эти общие DEP намекают на общие молекулярные механизмы и сигнальные пути, вовлеченные в четыре подтипа NFPA.

Четыре DEP (SSP 2101, 4215, 2624 и 1608) были общими только для трех подтипов NFPA (NF-, LH- и LH/FSH-), включая три белка с пониженной экспрессией (цепь соматотропина 1, предшественник пролактина, и дипептидилпептидаза II) и один белок с повышенной экспрессией (бета-цепь митохондриальной АТФ-синтазы).Три DEP-пятна (SSP 4216, 8102 и 1105) были общими только для трех подтипов NFPA (LH-, FSH- и LH/FSH-), включая два белка с пониженной экспрессией (пролактиновая цепь 1 и фосфолипидгидропероксидглутатионпероксидаза). ) и один белок с повышенной экспрессией (лактоилглутатионлиаза). Два DEP-пятна (SSP 2001 и 7106) были общими только для трех подтипов NFPA (NF-, FSH- и LH/FSH-), включая один белок с пониженной экспрессией (гликопротеин CD59) и один белок с повышенной экспрессией (40 кДа пептидилпролилцис-трансизомераза).

Восемь DEP (SSP 4921, 8208, 0118, 1107, 2008, 3013, 4012 и 6115) были общими только для двух подтипов NFPA (LH- и FSH-), включая два подавляющих белка (коллаген альфа 2 VI цепь и каппа-цепь Ig V-III области SIE) и шесть белков с повышенной экспрессией (лактоилглутатионлиаза, НАДН-убихиноноксидоредуктаза 23 кДа, энхансер рудиментарного гомолога, ацил-КоА-связывающий белок, полипептид цитохром с-оксидазы VIb и нейрональный белок НП25). Четыре DEP (SSP 0812, 5003, 1610 и 1705) были общими только для двух подтипов NFPA (NF- и LH-), включая два белка с пониженной экспрессией (антиген отторжения опухоли 1 и цепь бета-2 гемоглобина) и два белки с повышенной экспрессией (виментин и диссоциация Rab GDP).Три DEP (SSP 2303, 3210 и 5617) были общими только для двух подтипов NFPA (NF- и FSH-), включая два белка с пониженной экспрессией (серин/треонинпротеинфосфатаза 2A — регуляторная субъединица B альфа-изоформа 55 кДа, и белок теплового шока 27) и один активный белок (протоонкогенная тирозин-протеинкиназа FYN). Одно пятно DEP (SSP 7016) было общим только для двух подтипов NFPA (FSH- и LH/FSH-), которое представляло собой белок с пониженной регуляцией (цепь альфа-2 гемоглобина).

Два DEP (SSP 1012 и 1117) были специфичны для NF-NFPA, которые представляли собой два белка с пониженной активностью (изоформа сплайсинга 3 предшественника казеина альфа-s1 и аполипопротеин A-I).Два DEP (SSP 2311 и 3222) были специфичны для FSH-NFPA, включая один белок с пониженной регуляцией (протоонкогенный белок L-Myc-1) и один белок с повышенной регуляцией (белок эндоплазматического ретикулума ERP29). Одно пятно DEP (SSP 1017) было специфичным для LH-NFPA, которые содержали два белка с пониженной экспрессией (соматотропин и сплайс-изоформа 2 предшественника соматотропина). Одно пятно DEP (SSP 7519) было специфичным для LH/FSH-NFPA, который представлял собой один белок с повышающей регуляцией (матриксная металлопротеиназа-19).

Вариации в сетях сигнальных путей среди четырех подтипов NFPA

Каждый белок функционирует в организованной, систематической и динамической системе сети путей.Программа Ingenuity Pathway Analysis (IPA) использовалась для выяснения сетей путей, которые включают каждый DEP, и для изучения потенциальных биологических функций этих DEP в каждом подтипе NFPA (NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-). DEP были проанализированы с помощью IPA для определения значимых сетей путей, канонических путей, биологических событий заболеваний и событий биологической токсичности, а также для выявления вариаций в сетях сигнальных путей для получения сетей путей, канонических путей, биологических событий заболеваний и событий биологической токсичности, которые были обычными или специфичные для каждого подтипа NFPA.

Различия в сетях путей

Для NF-NFPA анализ сети путей 59 DEP в NF-NFPA выявил три статистически значимые сети путей, которые включают DEP, связанные с NF-NFPA (рис. 4A). Эти узлы в верхней половине рисунка 4A соответствуют молекулам (генам; белкам), которые представлены в нижней половине рисунка 4A. NF-сеть 1 функционирует в передаче сигналов и взаимодействии между клетками, развитии и функционировании гематологической системы и отслеживании иммунных клеток; и включает 35 узлов (гены; белки).Среди этих 35 узлов 18 DEP (51% от общего числа узлов) были идентифицированы как MS. Ключевую роль в этой сети играют ERK1/2, PRL, APOA1, бета-TGF, LDL, NOS, комплекс IL12, HSPB1 и YWHAQ. NF-сеть 2 функционирует в развитии и функционировании сердечно-сосудистой системы, развитии организма, развитии и функционировании нервной системы; и включает 35 узлов (гены; белки). Среди этих 35 узлов девять DEP (26% от общего числа узлов) были идентифицированы MS. Ключевую роль в этой сети играют ERK, Gh2, PKA, RAS, Akt, VEGF, MAPK, FYN, p85 (pik3r), комплекс PI3K и инсулин.NF-сеть 3 функционирует при заболеваниях слуха, нарушениях развития и нарушениях эндокринной системы; и включает 35 узлов (гены; белки). Среди этих 35 узлов восемь DEP (23% от общего числа узлов) были идентифицированы MS. Ключевую роль в этой сети играют UBC, FBXO32, P38 MAPK, комплекс NFkB, комплекс PI3K и PKC.

Рисунок 4

Сети сигнальных путей в различных подтипах клинически NFPA. А . НФ-НФПА. Б . ЛХ-НФПА. С . ФСГ-НФПА. Д .ЛГ/ФСГ-NFPA.

Для LH-NFPA анализ сети путей 65 DEP в LH-NFPA выявил три статистически значимые сети путей, которые включают связанные с LH-NFPA DEP (рис. 4B). Эти узлы в верхней половине рисунка 4B соответствовали молекулам (генам; белкам), обобщенным в нижней половине рисунка 4B. LH-сеть 1 функционирует в развитии и функционировании сердечно-сосудистой системы, развитии организма и раке; и включает 35 узлов (гены; белки). Среди этих 35 узлов 16 DEP (46% от общего числа узлов) были идентифицированы MS.Ключевую роль в этой сети играют ERK1/2, PRL, Gh2, LH, MAPK, PKC, PKA, 14-3-3, рецептор эстрогена, бета-TGF и инсулин. LH-сеть 2 функционирует в клеточном цикле, репликации ДНК, рекомбинации и репарации, эмбриональном развитии; и включает 35 узлов (гены; белки). Среди этих 35 узлов 10 DEP (29% от общего числа узлов) были идентифицированы MS. UBC, CDC37 и COX6B1 играют ключевую роль в этой сети. ЛГ-сеть 3 функционирует в межклеточной передаче сигналов и взаимодействии, клеточном росте и пролиферации, развитии и функционировании гематологической системы; и включает 35 узлов (гены; белки).Среди этих 35 узлов 10 DEP (29% от общего числа узлов) были идентифицированы MS. Ключевую роль в этой сети играют P38 MAPK, Akt, ERK, комплекс NF-kB, CD3, IgG, IL15, комплекс IL12, Jnk, VEGF и TGM2.

Для FSH-NFPA анализ сети путей 63 DEP в FSH-NFPA выявил три статистически значимые сети путей, которые включают DEP, связанные с FSH-NFPA (рис. 4C). Эти узлы в верхней половине рисунка 4C соответствовали молекулам (генам; белкам), которые были суммированы в нижней половине рисунка 4C.ФСГ-сеть 1 функционирует в развитии и функционировании сердечно-сосудистой системы, развитии организма и раке; и включает 35 узлов (гены; белки). Среди этих 35 узлов 17 DEP (49% от общего числа узлов) были идентифицированы как MS. Ключевую роль в этой сети играют ERK1/2, PKA, PLC, TGF бета, TGM2, LH, Gh2, PRL и инсулин. ФСГ-сеть 2 функционирует в метаболизме липидов, метаболизме нуклеиновых кислот и биохимии малых молекул; и включает 35 узлов (гены; белки). Среди этих 35 узлов 13 DEP (37% от общего числа узлов) были идентифицированы MS.Ключевую роль в этой сети играют UBC, CDC37 и GSK3B. ФСГ-сеть 3 функционирует при наследственных заболеваниях, неврологических заболеваниях, повреждениях и аномалиях организма; и включает 35 узлов (гены; белки). Среди этих 35 узлов 9 DEP (26% от общего числа узлов) были идентифицированы MS. P38 MAPK, Akt, ERK, комплекс NF-kB, VEGF, Jnk, MAPK, комплекс PI3K, Creb, PKC и HSPB играют ключевую роль в этой сети.

Для ЛГ/ФСГ-NFPA анализ сети путей 55 DEP в LH/FSH-NFPA выявил три статистически значимые сети путей, которые включают связанные с LH/FSH-NFPA DEP (рис. 4D).Эти узлы в верхней половине рисунка 4D соответствуют тем молекулам (генам, белкам), которые представлены в нижней половине рисунка 4D. ЛГ/ФСГ-сеть 1 функционирует в развитии и функционировании сердечно-сосудистой системы, развитии организма и раке; и включает 35 узлов (гены; белки). Среди этих 35 узлов 17 DEP (49% от общего числа узлов) были идентифицированы как MS. Ключевую роль в этой сети играют ERK1/2, Jnk, AP1, NOS, AKR1B1, PRL, LH, PLC, PKC, Gh2, STAT5a/b, рецептор эстрогена, ADCY и инсулин. ЛГ/ФСГ-сеть 2 функционирует при межклеточной передаче сигналов и взаимодействии, дерматологических заболеваниях и состояниях и нарушениях развития; и включает 35 узлов (гены; белки).Среди этих 35 узлов 7 DEP (20% от общего числа узлов) были идентифицированы MS. MAPK, TGM2, ERK, комплекс NF-kB, комплекс IL12, VEGF, Creb, Akt, PKA, P38 MAPK, IgG и CD3 играют ключевую роль в этой сети. ЛГ/ФСГ-сеть 3 функционирует в посттрансляционной модификации, гибели и выживании клеток и экспрессии генов; и включает 35 узлов (гены; белки). Среди этих 35 узлов 6 DEP (17% от общего числа узлов) были идентифицированы MS. Ключевую роль в этой сети играют UBC, CDC37, SOSTM1, PRKACA и CREB1.

Комплексный анализ четырех наборов сетей путей (рис. 4A-D) выявил: (i) сеть путей (сеть NF-2, сеть LH-1, сеть FSH-1 и сеть LH/FSH-1) была высоко сходны между NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-NFPA и действуют при раке, развитии и функционировании сердечно-сосудистой системы, развитии организма, развитии и функционировании нервной системы; и узлы ERK1/2, Gh2, LH, инсулин и PRL играют ключевые роли в этой общей сети путей.Однако они не одинаковы и демонстрируют различия между NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-NFPA. (ii) Сеть путей (NF-сеть 1, LH-сеть 3 и LH/FSH-сеть 2) очень похожа среди NF-, LH- и LH/FSH-NFPA и функционирует от клетки к клетке. передача сигналов и взаимодействие, развитие и функция гематологической системы, отслеживание иммунных клеток, рост и пролиферация клеток, дерматологические заболевания и состояния и нарушение развития; сеть ФСГ-сеть 3 очень похожа на три вышеупомянутые сети и функционирует при наследственных заболеваниях, неврологических заболеваниях, повреждениях и аномалиях организма.(iii) сети NF-сеть 3, LH-сеть 2, FSH-сеть 2 и LH/FSH-сеть 3 принципиально разные, однако имеют общие узлы UBC и CDC37, а остальные узлы практически разные.

Различия в канонических путях

Среди этих DEP в четырех подтипах NFPA анализ сети путей выявил 34 статистически значимых канонических пути, которые включают DEP в NF-NFPA, 21 в LH-NFPA, 28 в FSH-NFPA и 18 в LH/ ФСГ-NFPA. Был проведен сравнительный анализ этих важных канонических путей среди NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-NFPA (рис. 5).(i) В общей сложности 12 канонических путей были общими для четырех подтипов NFPA, включая передачу сигналов арилуглеводородного рецептора, роль JAK2 в передаче сигналов гормоноподобных цитокинов, передачу сигналов гормона роста, активацию TR/RXR, передачу сигналов IGF-1, гемопоэз из мультипотентного стебля клетки, гидролиз ацил-КоА, биосинтез серотонина и мелатонина, внешний путь активации протромбина, расщепление метилглиоксаля III, опосредованный NRF2 ответ на окислительный стресс и продукцию IL-15 (рис. 5A). (ii) Два важных канонических пути были общими только для трех подтипов NFPA (NF-, LH- и FSH-), включая передачу сигналов PI3K/AKT и передачу сигналов альдостерона в эпителиальных клетках (рис. 5B).(iii) Три важных канонических пути были общими только для трех подтипов NFPA (LH-, FSH- и LH/FSH-), включая митохондриальную дисфункцию, окислительно-восстановительные реакции глутатиона I и деградацию метилглиоксаля I (рис. 5C). (iv) Один важный канонический путь, внутренний путь активации протромбина, был общим только для трех подтипов NFPA (NF-, LH- и LH/FSH-) (рис. 5C). (v) Три важных канонических пути были общими только для двух подтипов NFPA (NF- и LH-), включая активацию PPARα/RXRα, 14-3-3-опосредованную передачу сигналов и передачу сигналов RhoGDI (рис. 5B и C).(vi) Десять значимых канонических путей были общими только для двух подтипов NFPA (NF- и FSH-), включая передачу сигналов ERK/MAPK, передачу сигналов пролактина, передачу сигналов CTAL4 в цитотоксических Т-лимфоцитах, роль тканевого фактора в развитии рака, передачу сигналов p70S6K, синаптические длительная депрессия, передача сигналов киназы Tec, передача сигналов Wnt/β-катенина, роль NFAT в регуляции иммунного ответа и передача сигналов рецептора эфрина (рис. 5B и C). (vii) Один важный канонический путь, окислительное фосфорилирование, был общим только для двух подтипов NFPA (LH- и FSH-) (рис. 5C).(viii) Шесть важных канонических путей были специфичны только для NF-NFPA, включая митотическую роль Polo-подобной киназы, путь убиквитинирования белка, передачу сигналов метаболизма ксенобиотиков, передачу сигналов теломеразы, продукцию оксида азота и активных форм кислорода в макрофагах и передачу сигналов ILK ( Рисунок 5B и C). (ix) Один важный канонический путь, передача сигналов болезни Хантингтона, был специфичен только для ЛГ/ФСГ-NFPA (рис. 5C).

Рисунок 5

Канонические пути, которые являются общими и специфическими для различных подтипов клинически NFPA (панели A, B и C). Синяя полоса означает NF-NFPA. Голубая полоса означает LH-NFPA. Зеленая полоса означает FSH-NFPA. Темная полоса означает LH/FSH-NFPA.

Различия в биологических событиях болезни

Среди DEP в четырех подтипах NFPA анализ сети путей выявил 77 статистически значимых биологических событий болезни, которые связаны с NF-NFPA, 76 с LH-NFPA, 76 с FSH-NFPA и 79 с LH/FSH -NFPA. Был проведен сравнительный анализ этих значительных биологических событий среди NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-NFPA (дополнительный файл 1: рисунок S1).(i) В общей сложности 70 биологических функциональных событий заболевания были общими для четырех подтипов NFPA (NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-) (дополнительный файл 1: рисунок S1A-E), включая рак, развитие и функцию. клеточных, тканевых и множественных систем органов, морфологии клеток, тканей, органов и опухолей, множественных заболеваний и расстройств, включая воспалительные и неврологические заболевания, воспалительных и иммунных реакций, передачи сигналов и взаимодействия между клетками, гибели и выживания клеток, клеточное движение, клеточный рост и пролиферация, синтез белка, метаболизм липидов, молекулярный транспорт, клеточный цикл, метаболизм углеводов, производство энергии, метаболизм витаминов и минералов, метаболизм нуклеиновых кислот, репликация ДНК, рекомбинация и репарация, метаболизм аминокислот, метаболизм лекарств, пост- трансляционная модификация, поведение и т. д.(ii) Некоторые биологические явления болезни не были общими для всех подтипов NFPA (дополнительный файл 1: рисунок S1F), включая деградацию белка, сворачивание белка, перенос белка и удаление свободных радикалов и т. д.

Различия в событиях биологической токсичности

Среди DEP в четырех подтипах NFPA, анализ сети путей идентифицировал 21 статистически значимый случай биологической токсичности, связанный с DEP в NF-NFPA, 12 в LH-NFPA, 14 в FSH-NFPA и 17 в LH/FSH-NFPA. Сравнительный анализ этих значительных явлений биологической токсичности был проведен среди NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-NFPA (дополнительный файл 1: рисунок S2).(i) Десять событий биологической токсичности были общими для четырех подтипов NFPA (NF-, LH-, FSH- и LH/FSH-), включая сердечную аритмию, гипертрофию печени, воспаление почек, почечный нефрит, легочную эмболию сердца, сердечный стеноз, повышенный уровень билирубина, почечная недостаточность, повышенный уровень калия и истощение глутатиона в печени. (ii) Два события биологической токсичности были общими только для трех подтипов NFPA (NF-, FSH- и LH/FSH-), включая повышенный уровень гематокрита и повышенный уровень эритроцитов.(iii) Два события биологической токсичности были общими только для двух подтипов NFPA (NF- и LH/FSH-), включая инфаркт миокарда и некроз сердца/гибель клеток. (iv) Одно событие биологической токсичности, гиперплазия/гиперпролиферация печени, было общим только для двух подтипов NFPA (NF- и LH-). (v) Два события биологической токсичности были общими только для двух подтипов NFPA (NF- и FSH-), включая некроз почек/гибель клеток и повреждение клубочков. (vi) Четыре события биологической токсичности были специфичны для NF-NFPA, включая фиброз сердца, воспаление сердца, сердечную артериопатию и цирроз печени.(vii) Три события биологической токсичности были специфичны для ЛГ/ФСГ-NFPA, включая сердечную недостаточность, некроз печени/гибель клеток и повреждение печени.

Возможная причина электрофоретической и хроматографической гетерогенности гормонов гипофиза

  • Carsten, M.E., and Pierce, J.G., J. Biol. хим. , 235 , 78 (1960).

    КАС пабмед Google ученый

  • Кондлиф П. Г., Бейтс Р., Garrison, M.M., and Howard, T.B., Biochim. Биофиз. Акта , 37 , 150 (1960).

    КАС Статья Google ученый

  • Bell, P. H., J. Amer. хим. соц. , 76 , 5565 (1954).

    КАС Статья Google ученый

  • Шеперд, Р. Г., Ховард, К. С., Белл, П. Х., Каччола, А. Р., Чайлд, Р. Г., Дэвис, М.C., English, J.P., Finn, B.M., Meisenhelder, J.H., Moyer, A.W., and Scheer, J. van der, J. Amer. хим. соц. , 78 , 5051 (1956).

    КАС Статья Google ученый

  • Диксон Дж. С., Ло Т. Б. и Ли С. Х., Архив. Биохим. Биофиз. , 92 , 296 (1961).

    КАС Статья Google ученый

  • Коул Р.D. и Li, CH, Archiv. Биохим. Биофиз. , 78 , 392 (1958).

    КАС Статья Google ученый

  • Cole, R.D., and Li, C.H., Biochim. Биофиз. Акта , 33 , 563 (1959).

    КАС Статья Google ученый

  • Ютис М. и Сквайр П. Г., Acta Endocrinol. , 37 , 96 (1961).

    Артикул Google ученый

  • Уорд, Д. Н., МакГрегор, Р. Ф., и Гриффин, А. С., Biochim. Биофиз. Акта , 32 , 305 (1959).

    КАС Статья Google ученый

  • Сквайр, П. Г., Ли, С. Х., и Андерсен, Р. Н., Биохимия , 1 , 412 (1962).

    КАС Статья Google ученый

  • Ли, К.H. и Papkoff, H., J. Biol. хим. , 204 , 391 (1953).

    КАС пабмед Google ученый

  • Ferguson, K.A., and Wallace, A.L.C., Rec. прогр. Гормон Рез. , 19 , 1 (1963).

    КАС Google ученый

  • Li, C.H., Geschwind, I.I., Dixon, J.S., Levy, A.L., and Harris, J.I., J. Biol. хим., 213 , 171 (1955).

    КАС пабмед Google ученый

  • Lewis, U. J., J. Biol. хим. , 237 , 3141 (1962).

    КАС пабмед Google ученый

  • Reisfeld, R. A., Tong, G. L., Rickes, E. L., Brink, N. G., and Steelman, S. L., J. Amer. хим. соц. , 83 , 3717 (1961).

    Артикул Google ученый

  • Слюйсер, М.и Li, CH, Archiv. Биохим. Биофиз. , 104 , 50 (1964).

    КАС Статья Google ученый

  • Squire, P.G., Starman, B., and Li, C.H., J. Biol. хим. , 238 , 1389 (1963).

    КАС пабмед Google ученый

  • Ква, Х. Г., ван дер Бент, Э. М., Рюмке, Ф., Бонт, В., Блумендал, Х., и Слейсер, М.(В прессе).

  • Li, C.H., and Cummins, J.T., J. Biol. хим. , 233 , 73 (1958).

    КАС пабмед Google ученый

  • Синдром прерывания ножки гипофиза характеризуется генетической гетерогенностью

    Образец цитирования: Brauner R, Bignon-Topalovic J, Bashamboo A, McElreavey K (2020) Синдром прерывания ножки гипофиза характеризуется генетической гетерогенностью.ПЛОС ОДИН 15(12): е0242358. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0242358

    Редактор: Zoha Kibar, Center Hospitalier Universitaire Sainte-Justine, CANADA

    Получено: 19 марта 2020 г.; Принято: 30 октября 2020 г.; Опубликовано: 3 декабря 2020 г.

    Авторское право: © 2020 Brauner et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в рукописи, а все новые варианты депонированы в ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) с использованием кодов доступа VCV000978583, VCV000978582, VCV000978581, VCV000978580 , VCV000978579, VCV000978578, VCV000978577, VCV000978576, VCV000978575, VCV000978574, VCV000978573, VCV000978572, VCV000978571, VCV000978570, VCV000978569, VCV000978568, VCV000978567 VCV000978566, VCV000978565, VCV000978564, VCV000978563, VCV000978562, VCV000978561, VCV000974009, VCV000929679, VCV000659978.

    Финансирование: Это исследование было поддержано Fondation Ophtalmologique Adolphe de Rothschild и Laboratoire Lilly France в форме финансирования, предоставленного RB.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Синдром прерывания ножки гипофиза (PSIS) представляет собой редкое заболевание, характеризующееся сочетанием специфических данных магнитно-резонансной томографии (МРТ), включая отсутствие или эктопию задней доли гипофиза, отсутствие или прерывание ножки гипофиза и гипоплазию передней доли гипофиза [1] .Эта триада может быть неполной. Последствия PSIS представляют собой ряд дефицитов передней доли гипофиза, включая дефицит гормона роста (GH), который может быть изолированным или может быть связан с дефицитом других гормонов, включая дефицит тиреотропного гормона, адренокортикотропного и/или лютеинизирующего гормона/фолликулостимулирующего гормона. Дефицит задней доли гипофиза, приводящий к центральному несахарному диабету, очень редко встречается при ПССИ. Клиническая картина PSIS неоднородна и может включать гипогликемию, судороги, желтуху, микропенис, крипторхизм или замедление скорости роста в более позднем возрасте [2].ПСИС может сочетаться с другими врожденными аномалиями, преимущественно офтальмологическими, которые могут быть изолированными или в составе синдромов, а также умственной отсталостью или эпилепсией [2–6]. Последние рассматриваются как вторичные по отношению к эпизоду гипогликемии вследствие дефицита гормона роста и адренокортикотропного гормона, но они чаще (более частые и более выраженные), чем гипогликемические эпизоды вследствие дефицита гормона роста и адренокортикотропного гормона.

    Семейные формы составляют около 5% случаев [7]. В основном в этих формах были идентифицированы мутации в генах, в основном связанных с развитием гипофиза, включая LHX4 , OTX2 , HEX1 , SOX3 , PROKR2 , GPR161 4,

    [161,

    ].Недавно мы выявили мутации в генах CDON и ROBO1 у пациентов с PSIS и офтальмологическими аномалиями [16,17].

    Здесь мы использовали подход секвенирования экзома для выявления основных генетических причин ПСИС у 52, включая 2 семейных пациентов, наблюдаемых на предмет ПСИС одним и тем же детским эндокринологом. Мы идентифицировали патогенные и потенциально патогенные мутации в широком спектре генов, которые, как известно, участвуют в широком спектре биологических процессов.

    Пациенты, члены семьи и контрольная группа

    Письменное информированное согласие было дано всеми родителями и пациентами в возрасте старше 18 лет на клинико-биологическую оценку (включенную в их медицинскую карту) и на молекулярно-биологические анализы с использованием протоколов, утвержденных местными и национальными комитеты по этике научных исследований (Comité de Protection des Personnes Ile de France III, n°3445).Оценка гипофиза и последующее наблюдение проводились, как описано ранее [2].

    Это ретроспективное одноцентровое исследование было проведено с участием 52 человек (33 мальчиков и 19 девочек). Среди них 2 семьи, в каждой из которых по 2 больных ребенка. Пациенты с PSIS наблюдались на предмет гипоталамо-гипофизарной недостаточности старшим детским эндокринологом (Р. Браунер) в университетской больнице в период с 1978 по 2018 год, и для которых был доступен образец ДНК. В это исследование были включены 7 пациентов, у которых мутация была обнаружена ранее (пациенты 7, 8, 10, 17 и 37, таблица 1) и опубликована ( ROBO1 , CDON , HEX1 ) [11,16]. ,17].

    Методы

    Гипогликемия определялась как концентрация глюкозы в крови ниже 3 ммоль/л после 2-дневного возраста. Снижение скорости роста определяли как скорость роста в течение предыдущего года более чем на один балл стандартного отклонения ниже среднего значения для хронологического возраста или снижение стандартного отклонения роста более чем на 0,5 за 1 год у детей старше 2 лет. Микропенис определялся как длина полового члена менее 30 мм.

    Критерием диагностики дефицита ГР была пиковая реакция ГР менее 20 мЕд/л или 6.7 нг/мл после двух тестов фармакологической стимуляции или во время спонтанной гипогликемии, исключая ответ на СТГ-рилизинг-гормон, при низкой концентрации инсулиноподобного фактора роста 1. Поскольку мы использовали различные анализы ГР в течение периода исследования, мы выражали пиковую концентрацию ГР в мЕд/л с использованием коэффициентов преобразования (нг/мл в мЕд/л), которые были специфичны для международного стандарта, используемого для калибровки анализа ГР.

    Дефицит тиреотропного гормона был диагностирован при уровне свободного тироксина в плазме ниже 12 пмоль/л.Адренокортикотропный дефицит диагностировали по базальным концентрациям кортизола в плазме в 8 часов утра ниже 40 нг/мл (110 нмоль/л) у новорожденных и ниже 80 нг/мл (220 нмоль/л) у детей старшего возраста, без повышения во время гипогликемии и при низком/нормальном уровне. адренокортикотропная концентрация. Дефицит гонадотропинов диагностировали по отсутствию пубертатного развития в 13 лет у девочек и 14 лет у мальчиков, а также по отсутствию или частичному ответу гонадотропинов на тест со стимуляцией гонадотропин-высвобождающим гормоном [18]. Осмоляльность плазмы измеряли после водной депривации в течение 12 часов у 30 пациентов с сопутствующей осмоляльностью мочи у 23 из них.Все они были нормальными (от 275 до 300 мосмоль/кг в плазме и от 700 до 1300 мосмоль/кг в моче), за исключением одного случая, у которого развился несахарный диабет.

    Последующее наблюдение за каждым пациентом включало измерение концентраций свободного тироксина и кортизола в 8:00 каждые один или два года, если их концентрации ранее были нормальными, для диагностики отсроченного дефицита.

    Секвенирование экзома и анализ массива CGH

    Обогащение экзоном

    проводили, как описано в другом месте, с использованием Agilent SureSelect Human All Exon V4 [19].Секвенирование парных концов проводили на платформе Illumina HiSeq2000 со средним охватом секвенирования x50. Файлы чтения были созданы на платформе секвенирования с помощью проприетарного программного обеспечения производителя. Прочтения были нанесены на карту с использованием Burrows-Wheeler Aligner, а локальная перестройка сопоставленных прочтений вокруг потенциальных сайтов вставки/удаления (indel) была выполнена с помощью GATK версии 1.6. Варианты SNP и indel вызывали с использованием унифицированного генотипа GATK для каждого образца. Новизну SNP определяли по отношению к dbSNP138.Наборы данных были отфильтрованы на наличие новых или редких (MAF<0,01) вариантов. Новые и редкие варианты были проанализированы с помощью ряда веб-инструментов биоинформатики с использованием EnsEMBL SNP Effect Predictor (http://www.ensembl.org/homosapiens/userdata/uploadvariations). Все варианты были проверены вручную с использованием базы данных Human Gene Mutation Professional [Biobase] (http://www.biobase-international.com/product/hgmd). Был проведен анализ In silico для определения потенциальной патогенности вариантов с использованием Polyphen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph) и онлайн-инструменты SIFT (http://sift.jcvi.org/www/SIFT_chr_coords_submit.html), которые предсказывают влияние мутаций человека на функцию белка. Мы сосредоточили наши анализы на несинонимичном кодировании, бессмыслице и вариантах сайта сплайсинга, отфильтровав все известные общие варианты, содержащиеся в dbSNP (сборка 138) (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), 1000 геномов. Project (http://www.1000genomes.org/) и в базе данных gnomAD (http://gnomad.broadinstitute.org/). Собственная база данных из 700 экзомов от контрольных людей или людей с неродственными патологиями также была проверена на наличие потенциальных патогенных вариантов, идентифицированных в когорте PSIS.Варианты подтверждали визуальным осмотром с использованием браузера IGV или секвенированием по Сэнгеру. Варианты классифицировали в соответствии с рекомендациями ACMG [20]. В подавляющем большинстве случаев ДНК родителей была недоступна для изучения, поэтому анализ трио был невозможен. Наборы данных Exome также сравнивали с внутренним контрольным набором данных из> 700 экзомов. Кариотипирование проводили стандартными методами, хромосомы наблюдали после окрашивания G и R. FISH-анализ проводили с использованием зондов, меченных FITC или родамином, локализованных в областях хромосомных разрывов.Для массива CGH анализ числа копий всего генома выполняли с использованием массивов Illumina CytoSNP12 BeadChip (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США). Образцы обрабатывали с помощью анализа Infinium, а результаты анализировали с помощью программного обеспечения Illumina Genome Studio.

    Результаты и обсуждение

    Возраст на момент постановки диагноза PSIS index варьировал от рождения до 10,8 лет (таблица 1). Среди 52 пациентов кровное родство имело место в двух случаях (случаи 27 и 28), а в случае 25 отец внезапно умер в возрасте 45 лет.Исходным симптомом, приведшим к постановке диагноза PSIS, была гипогликемия в 18 (34,6%) случаях, судороги с сопутствующей гипогликемией в 3 (5,7%), желтуха в 6 (11,5%) и/или замедление скорости роста в 30 (57,7%) случаях. . По данным МРТ у всех пациентов была обнаружена эктопия задней доли гипофиза, кроме 6 пациентов, у которых она не была видна, и у одного пациента с небольшой задней долей гипофиза, связанной с прерванным стеблем (случай 1). Таким образом, ножка гипофиза была определена как прерванная (n = 19 с узлом в наблюдении 27), ненаблюдаемая (n = 21), тонкая (n = 8), нормальная (n = 3) и крупная (n = 1).Сагиттальная срединная высота передней доли гипофиза была <1 мм или отсутствовала у 9 пациентов. Сопутствующие симптомы или синдромы (36 случаев, 69,2%) подробно описаны в таблице 1. Пороки развития глаза присутствуют в 16 случаях (30,8%).

    Дефицит ГР был изолированным в 21 случае (40,4%), или связанным с изолированным дефицитом тиреотропина в 4 случаях (7,7%), или множественным дефицитом, включая дефицит гонадотропинов в 23 (44,2% или 56,1% после исключения 11 в препубертатном возрасте). Только у одного пациента был несахарный диабет (случай 4).У двух пациентов было раннее половое созревание. У трех девочек (случаи 8, 18 и 27) была вторичная аменорея, связанная с дефицитом тиреотропина, после нормального пубертатного развития, несмотря на нормальный пубертатный ответ гонадотропинов на тест на гонадотропин-рилизинг-гормон. Они расценивались как имеющие частичный дефицит гонадотропинов [18].

    Неоднородность клинической картины больных ПСИС объясняется большим разнообразием генов, несущих потенциально патогенные варианты. У 39 человек мы выявили генетические варианты, которые могут способствовать возникновению сложных фенотипов, наблюдаемых в этой серии пациентов (таблица 2).Анализ Array-CGH указывал на нормальную плоидность и не указывал на изменения числа копий гена, связанные с фенотипами. Однако секвенирование экзома выявило редкие и новые варианты в генах, которые, как известно, участвуют в одном или нескольких из следующих процессов: развитии срединной линии и/или развитии или функции гипофиза ( BMP4 , CDON , GLI2 , GLI3 , Hesx1 , Kiaa0556, Kiaa0556, , LHX9 , NKX9 , NKX2-1 , NKX2-1 , PROP1 , PTCH2 , Shh2 , ShH , TBX19 , TBX1 , TGIF1 ), синхромые и неиндусшивые формы гипогонадотропного гипогонадина (HH; CCDC141 , chd7 , FANCA , FANCC , FANCD2 , Fance , FANCG , IL17RD , KISS1R , NSMF , PMM2 , SEMA3E , WDR11 ), синдромые формы короткого роста ( FGFR3 , NBAs , PRMT7 , RAF1 , SLX4 , SLX4 , SMARCA2 , SOX11 ), CereEbellum ATR Ophy с оптическими аномалиями ( DNMT1 ), аксовая миграция ( Robo1 , Slit2 , Slit2 ) и агенез корпус Callosum ( ARID1B , CC2D2A , CEP120 , CSPP1 , DHCR7 , DHCR7 , INPP5E , VPS13B , ZNF423 ).В большинстве случаев эти варианты также отсутствовали в домашнем контроле или встречались с очень низкой частотой (табл. 2).

    Другие варианты, которые внесли свой вклад в клинический фенотип пациента, но не вовлечены в PSIS, включают пациента 6 с муковисцидозом, гомозиготного по варианту с общей делецией (del:p.507_508del), вариантов WT1 (p.P84S, p.A93G), связанный с семейным анамнезом почечных аномалий в семье 28, и вариант FSHR (p.R484H) у пациента 29, связанный с низкими уровнями ингибина B, свидетельствующими о недостаточности яичников.

    У нескольких пациентов были выявлены сложные синдромы, о которых ранее не сообщалось о PSIS. В некоторых из этих случаев фенотип может быть обусловлен комбинацией вариантов генов, а не одним вариантом. Пациент 1 имел тяжелую раннюю эпилепсию и интеллектуальную недостаточность, недостаточность гипофиза, а также микропенис. МРТ показала PSIS, что привело к клиническому диагнозу PSIS и синдрома Николаидеса-Барайцера. У этого ребенка были патогенные и вероятно патогенные варианты в PROP1 и IL17RD , а также вероятно патогенный вариант в SMARCA2 .Варианты последнего являются известной причиной синдрома Николаидеса-Барайтсера. PROP1 и/или варианты IL17RD . Сообщалось об аномалиях ножки гипофиза в связи с гомозиготным вариантом с потерей функции в PROP1 , однако описанный здесь ребенок является гетерозиготным по варианту LOF [22].Чтобы решить эту проблему, другим пациентам с синдромом Николаидеса-Барайцера или гипогонадотропным гипогонадизмом необходимо будет пройти скрининг PSIS с помощью МРТ.

    Пациенты 4 и 6 имеют биаллельные или гомозиготные варианты NBAS . Варианты в NBAS связаны с аутосомно-рецессивными формами либо синдрома детской печеночной недостаточности 2, либо низкого роста, атрофии зрительного нерва и аномалии Пельгера-Хюэта [23,24]. У пациента 4 недиагностированная синдромальная форма низкого роста.Некоторые аспекты фенотипа могут быть связаны с патогенными вариантами NBAS , в том числе с несахарным диабетом при рождении, левосторонней анофтальмией и агенезией зрительного нерва и хиазмы. Однако о других особенностях, связанных с вариантами NBAS , не сообщалось, включая отсутствие турецкого седла и гипофиза, гипоплазию валика мозолистого тела, решетчатое менингоцеле и кисту septum lucidum. Ребенок также был носителем двух редких вариантов в гене KIAA0556 , где ранее сообщалось о гомозиготных вариантах в KIAA0556 в связи с микропенисом, гипофизарной гипоплазией, аномалиями ножки гипофиза, расщелиной неба и гипоплазией мозжечка при синдроме Жубера 26 [25].Чтобы еще больше усложнить интерпретацию данных, ребенок также несет редкий вариант миссенс в ROBO1 . вариантов ROBO1 связаны с PSIS и аномалиями зрительного нерва [17,26,27]. Не исключено, что сложный фенотип может быть обусловлен вкладом каждого из этих вариантов. Однако наблюдение пациента 6 с неонатальной гипогликемией и желтухой из-за острой печеночной недостаточности и наличием двух редких вариантов NBAS подразумевает, что PSIS может быть частью фенотипического спектра, связанного с патогенными вариантами NBAS [24].У ребенка также был муковисцидоз из-за гомозиготного варианта CFTR .

    У пациента 9 синдромальная форма низкого роста, состоящая из гипогликемии, судорог, гипотиреоза, гипогонадизма и задержки развития. МРТ показало PSIS. На основании клинического фенотипа у ребенка был первоначальный клинический диагноз СТГ и адренокортикотропной недостаточности, ответственных за гипогликемию и судороги, а также вторичную умственную отсталость. Девочка является носителем нового гетерозиготного варианта со сдвигом рамки PMM2 .Однако врожденное нарушение гликозилирования типа 1а, которое вызывается биаллическими вариантами в PMM2, является аутосомно-рецессивным заболеванием, и варианты LOF PMM2 распространены в общей популяции ([28]; https://gnomad.broadinstitute.org/ ген/ENSG00000140650?dataset=gnomad_r2_1). Таким образом, хотя аспекты фенотипа согласуются с врожденным нарушением гликозилирования, патогенность варианта PMM2 p.Q85fs неясна. Девочка также является носителем предсказанного вероятного патогенного редкого варианта миссенс в WDR11 .Варианты WDR11 связаны с аутосомно-доминантной формой ГГ [29]. Недавно сообщалось о гетерозиготном варианте p.I436V WDR11 у ребенка с комбинированным дефицитом гормонов гипофиза, маленькой передней долей гипофиза, эктопированной задней долей и тонкой прерванной ножкой [13]. У этого ребенка также была потеря функции PROKR2 (p.R85C), и считалось, что аномалии гипофиза связаны с обоими этими вариантами.

    Пациент 11 имел сложный фенотип, состоящий из низкого роста, гипогликемии и мозжечковой атаксии с гипоплазией мозжечка.Первоначально пациенту был поставлен клинический диагноз с двумя независимыми проявлениями: неврологическими особенностями, вторичными по отношению к недоношенности и перинатальной аноксии и гипогликемии, а также задержке развития из-за гипоталамо-гипофизарной недостаточности. Секвенирование экзома показало, что больной мальчик является носителем нового миссенс-варианта, p.D953G, в бром-прилегающем домене гомологии 2 (BAh3) метилтрансферазы DNMT1 [30]. Домен BAh3 необходим для контроля взаимодействия метилтрансферазы с большой бороздкой ДНК [31].Гетерозиготные патогенные варианты DNMT1 связаны с аутосомно-доминантными нейродегенеративными заболеваниями, поражающими как центральную, так и периферическую нервную систему. Интересно, что варианты в экзоне 20 DNMT1 приводят к наследственной сенсорной и вегетативной нейропатии типа ИЭ [32], а варианты в экзоне 21 вызывают аутосомно-доминантную мозжечковую атаксию, глухоту и нарколепсию. Оба этих экзона кодируют домен последовательности фокуса репликации (RFTS) [33]. Здесь у мальчика мозжечковая атаксия с гипоплазией мозжечка, которая была обнаружена на МРТ в 2 года.7 лет. Данных ни за глухоту, ни за нарколепсию нет. Пораженный остаток аспарагиновой кислоты 953 высоко консервативен у позвоночных. Интересно предположить, что этот фенотип, включая PSIS, может быть специфически обусловлен патогенными вариантами в этом домене белка DNMT1. Действительно, было показано, что белок DNMT1 физически взаимодействует с HESX1, белком, который необходим для развития гипофиза, и он коэкспрессируется с Hesx1 во время развития гипофиза мышей [34]. Варианты HESX1 связаны с аномалиями гипофиза, и мы ранее описали вариант HESX1, связанный с PSIS (случай 37; 11).

    У пациента 21 диагностирована глухота в течение первого года, крипторхизм, а затем замедление темпов роста. Клиническим диагнозом первоначально считался дефицит гормона роста из-за PSIS, который считался независимым от глухоты. Однако крипторхизм не был объяснен, так как не был связан с дефицитом гонадотропина. Анализ набора данных секвенирования экзома показал, что он является носителем нового варианта RAF1 p.A586S, расположенного в высококонсервативной области CR3.Патогенные варианты, в том числе локализованные в домене CR3, связаны с широким спектром фенотипов, включая синдром Нунан 5, синдром LEOPARD и несиндромальную кардиомиопатию [35]. Патогенные варианты RAF1 имеют тенденцию группироваться в двух региональных горячих точках (CR2 ser259 или CR3 ser612). Хотя патогенные варианты в CR3 обычно не связаны с кардиомиопатией, вклад варианта RAF1 p.A586S в фенотип пациента 21 неясен.

    У пациента 24 тяжелая умственная отсталость, гипогликемия, ожирение, судороги, дисфункция щитовидной железы и хореоатетоз.ПСИС был диагностирован на МРТ, выполненной при оценке умственной отсталости. Несмотря на полный дефицит гормона роста, у этой девочки был спонтанный нормальный рост с ростом выше среднего. Об этой необычной особенности сообщалось в сообщениях о гипогликемии, ведущей к чрезмерному потреблению глюцидов и ожирению. Эта девочка является носителем известного патогенного варианта PRMT7 [36]. Биаллельные варианты в PRMT7 связаны с аутосомно-рецессивной формой низкого роста, брахидактилией, нарушениями умственного развития и судорогами [36]. Однако этот вариант является гетерозиготным и вряд ли отвечает за фенотип.Однако у девушки также есть редкие или новые варианты миссенс в NKX2-1 и SOX11 . Варианты SOX11 связаны с аутосомно-доминантной формой низкого роста с интеллектуальной недостаточностью как часть синдрома Коффина-Сириса 9 [37,38]. Однако все патогенные варианты SOX11, о которых сообщалось на сегодняшний день, попадают в функциональный домен HM-box (аминокислоты 47–122). Варианты вне HMG-бокса SOX11 связаны с врожденными аномалиями почек и мочевыводящих путей (CAKUT; [39]).Следовательно, мы считаем, что вариант SOX11 вряд ли отвечает за фенотип. Патогенные варианты NKX2-1 связаны с хореоатетозом, гипотиреозом и неонатальным респираторным дистресс-синдромом [40]. В литературе редко сообщается об ассоциации гипофизарных аномалий с вариантами NKX2-1. Однако при аномалиях гипофиза и/или ножки гипофиза сообщалось как о точечных мутациях, включающих NKX2-1, так и о делеции всего гена [41,42]. Сообщалось, что у больного отца и его дочери были соответственно низкие уровни ЛГ, что приводило к гипогонадизму, или низкие уровни ГР, вызывающие низкорослость.У обоих пациентов была задержка моторного развития и хорея. Уровень тиреотропного гормона у больной дочери был в норме. Оба случая содержали бессмысленный вариант в NKX2-1. Основываясь на сходстве между этой семьей и пациентом 24, мы предполагаем, что теперь есть доказательства, подтверждающие включение гипофизарных аномалий с NKX2-1.

    Генетическая вариация в нескольких генах, сообщаемых здесь, было недавно было предложено внести свой вклад в PSIS, включая ARID1B , BMP4 , CC2D2A , CCDC141 , CDON , CHD7 , DHCR7 , GLI2 , GLI2 , GLI2 , GLI2 , GLI2 , GLI3 , INPP5E , inpp5e , Kiaa0556 , Prop1 , Prokr2 , Shh , TGIF1 и WDR11 [13,16,17,43-48].Тем не менее, мы определили новые гены-кандидаты для PSIS, включая семь семей, которые несли варианты в генах, которые, как известно, участвуют в анемии Фанкони (пациенты, 5, 15, 20, 21, 25, 28 и 30), хотя только один случай (пациент 5 ) с синдромом Фанкони и микрофтальмией. Эти результаты могут не вызывать удивления, учитывая, что у части пациентов с анемией Фанкони наблюдается дефицит гормонов (дефицит гормона роста, гипогонадизм) и низкий рост [3,49]. Другие новые находки включают редкий миссенс-вариант SLIT2 с двумя редкими вариантами GLI2 (пациент 32).SLIT представляют собой консервативное семейство секретируемых белков, которые были первоначально обнаружены в нервной системе, где они передают сигналы через рецепторы ROBO для обеспечения направления и ветвления аксонов [50,51]. SLIT2 является лигандом для ROBO1, который, как мы и другие ранее показали, участвует в PSIS, предполагая вклад в развитие фенотипа.

    Наиболее частой генетической находкой в ​​этой группе были редкие/новые варианты, связанные с аномалиями развития гипофиза и/или ГГ с вариантами, наблюдаемыми в 14 из 29 семей (исключая пациентов в препубертатном возрасте).Из этих 29 случаев 14 носили либо гетерозиготные мутации более чем в одном гене, либо потенциально двуаллельные мутации в одном и том же гене. Это согласуется с предыдущими выводами об аутосомно-доминантных причинах гипофизарных аномалий и ди- или олигогенных причинах ГГ [52]. Во всей когорте у 17 пациентов был диагностирован гипогонадотропный гипогонадизм. Из этих случаев 6 не имели вариантов в генах, которые, как известно, вызывают HH. 11 из 23 носили редкие или новые варианты генов, которые, как известно, вызывают ГГ.Удивительно, но еще у 6 пациентов с потенциально патогенными вариантами генов HH не было HH.

    Эти варианты могут объяснить большинство симптомов/синдромов, представленных пациентами, включенными в эту серию и в другие опубликованные серии. Важно отметить, что нельзя исключить, что только один вариант у пациентов с несколькими вариантами отвечает за полный фенотип, а остальные могут иметь минимальный вклад в фенотип.Однако часть больных не объясняется генетическими вариантами в этих генах. Эти случаи могут быть связаны с мутациями в других генах, участвующих в развитии или функционировании гипофиза, которые в настоящее время не распознаны, или могут быть связаны с вариантами в некодирующих последовательностях, включая варианты числа копий, которые не были бы обнаружены в этом исследовании. В некоторых случаях, описанных выше, клиническая картина не полностью объясняется нашими текущими знаниями о биологической функции генов. Однако наши данные расширяют фенотипический спектр, связанный со многими генами, описанными в этом исследовании, а также предполагают, что PSIS может быть связан с гетерозиготными носителями аутосомно-рецессивных заболеваний.Аналогичные результаты были зарегистрированы для большой когорты людей с необъяснимой низкорослостью [53]. Hauer et al. наблюдали гетерозиготный вариант FGFR3 у индивидуума, у которого при начальных клинических проявлениях не было явных скелетных аномалий, связанных с патогенными вариантами FGFR3. Точно так же они обнаружили гетерозиготные варианты в генах, о которых ранее сообщалось, что они вызывают аутосомно-рецессивные скелетные дисплазии [53]. В этом исследовании мы также наблюдали гетерозиготные варианты в генах, которые, как сообщается, вызывают аутосомно-рецессивные заболевания, которые были связаны с PSIS и атипичными клиническими проявлениями (напр.грамм. корпус 24, PRMT7 ; случай 29, DHCR7 ). Как предполагают авторы, современные описания взаимоотношений генотип-фенотип неполны, и фенотипический спектр нуждается в расширении [53].

    Начальные проявления, приводящие к диагнозу PSIS, такие как судороги, умственная отсталость, микропенис или крипторхизм, обычно рассматриваются как вторичные по отношению к недостаточности гипофиза. Это исследование показывает, что они, вероятно, связаны с патогенными вариантами, ответственными за эпилепсию, развитие головного мозга или мозжечка, развитие щитовидной железы или гипогонадотропный гипогонадизм.В заключение, фенотипическая гетерогенность, наблюдаемая в связи с PSIS, отражается в сложной генетической гетерогенности. Во многих случаях PSIS можно рассматривать как часть фенотипического спектра других известных генетических синдромов, а не как конкретную клиническую единицу.

    Семейная изолированная аденома гипофиза: MedlinePlus Genetics

    Семейная изолированная аденома гипофиза (FIPA) — это наследственное заболевание, характеризующееся развитием доброкачественной опухоли в гипофизе (называемой аденомой гипофиза).Гипофиз, расположенный в основании головного мозга, вырабатывает гормоны, которые контролируют многие важные функции организма.

    Опухоли, формирующиеся в гипофизе, могут выделять избыточные уровни одного или нескольких гормонов, хотя некоторые опухоли не вырабатывают гормоны (нефункционирующие аденомы гипофиза). Те, которые это делают, обычно отличаются особыми гормонами, которые они производят. Пролактиномы являются наиболее распространенными опухолями при FIPA. Эти опухоли выделяют пролактин, гормон, который стимулирует выработку грудного молока у женщин.И у женщин, и у мужчин могут развиваться пролактиномы, хотя они чаще встречаются у женщин. У женщин эти опухоли могут привести к изменениям менструального цикла или затруднениям с беременностью. У некоторых пострадавших женщин может вырабатываться грудное молоко, даже если они не беременны и не кормят грудью. У мужчин пролактиномы могут вызывать эректильную дисфункцию или снижение интереса к сексу. В редких случаях у пораженных мужчин вырабатывается грудное молоко. Большие пролактиномы могут давить на близлежащие ткани, такие как нервы, которые передают информацию от глаз к мозгу (зрительные нервы), вызывая проблемы со зрением.

    Другой тип опухоли, называемый соматотропиномой, также часто встречается при FIPA. Эти опухоли выделяют гормон роста (также называемый соматотропином), который способствует росту организма. Соматотропиномы у детей или подростков могут приводить к увеличению роста (гигантизму), поскольку у них еще растут длинные кости рук и ног. У взрослых прекратился рост длинных костей, но опухоли могут вызывать разрастание рук, ног и лица (акромегалия), а также других тканей.

    Менее распространенные типы опухолей при FIPA включают соматолактотропиномы, нефункционирующие аденомы гипофиза, опухоли, секретирующие адренокортикотропный гормон (которые вызывают состояние, известное как болезнь Кушинга), тиреотропиномы и гонадотропиномы.В семье с этим заболеванием у пораженных членов может развиться опухоль одного и того же типа (гомогенная FIPA) или разных типов (гетерогенная FIPA).

    При FIPA опухоли гипофиза обычно возникают в более молодом возрасте, чем спорадические аденомы гипофиза, которые не передаются по наследству. В целом опухоли FIPA также больше, чем спорадические опухоли гипофиза. Часто у людей с FIPA есть макроаденомы, которые представляют собой опухоли размером более 10 миллиметров.

    Семейные аденомы гипофиза могут возникать как один из многих признаков других наследственных состояний, таких как множественная эндокринная неоплазия типа 1 и комплекс Карнея; однако в FIPA аденомы гипофиза описываются как изолированные, поскольку поражается только гипофиз.

    Транскриптомный и эпигенетический ландшафт одного ядра гипофиза демонстрирует гетерогенность стволовых клеток человека с различными регуляторными механизмами

    Введение

    Ткани состоят из нескольких типов клеток, которые могут принимать различные состояния экспрессии генов в ответ на сигналы окружающей среды 1 . Основные цели текущих биологических исследований включают разрешение клеточной гетерогенности в тканях и выяснение регуляторных механизмов, определяющих типы и состояния клеток.С недавним развитием технологий одноклеточных (sc) omics, исследователи уточнили характеристику типов клеток во многих тканях 2, 3 .

    Гипофиз выделяет гормоны, которые контролируют важнейшие физиологические процессы, включая размножение, обмен веществ и реакцию на стресс. Аденогипофиз представляет собой основную часть гипофиза и содержит пять линий клеток, продуцирующих гормоны. Несмотря на физиологическую значимость гипофиза в норме и болезни, в исследованиях RNAseq человека sc RNAseq до настоящего времени не рассматривался постнатальный гипофиз 4, 5 .Кроме того, картирование ландшафта эпигенома гипофиза не было включено в проект ENCODE 6, 7 , и не сообщалось о профилировании доступности хроматина гипофиза человека при подкожном разрешении.

    Особый интерес представляет информация о стволовых клетках гипофиза (PSC), которую можно получить с помощью подкожного анализа. Дефицит гормонов гипофиза, который включает врожденный гипопитуитаризм (комбинированный дефицит гормонов гипофиза), приобретенный гипопитуитаризм (вторичный по отношению к травме или хирургическому вмешательству), а также опухоли гипофиза, такие как аденомы, приводят к тяжелым нарушениям эндокринной системы и вызывают значительную заболеваемость 8 .Таким образом, существует необходимость в разработке терапии стволовыми клетками, которая могла бы восстановить утраченные или поврежденные популяции эндокринных клеток в гипофизе. Предыдущие исследования на мышах продемонстрировали существование PSCs и их способность к самообновлению и дифференцировке во все пять типов эндокринных клеток 9, 10 , таким образом открывая потенциальные терапевтические пути для гипофизарной недостаточности человека и опухолей гипофиза 11, 12 . Мало что известно об эпигенетическом ландшафте и динамике ПСХ человека в течение постнатальной жизни, что является важной информацией для реализации их терапевтического потенциала.Подкожные исследования гипофиза человека важны для определения клеточной идентичности и выявления регуляторных механизмов этого ключевого типа клеток.

    Одним из препятствий для характеристики гетерогенности ПСХ человека и выяснения механизмов регуляции генов с помощью подкожных исследований является техническая сложность получения высококачественных наборов данных из замороженных посмертных образцов гипофиза, предоставленных банками тканей. Недавно мы разработали интегрированный мультиомический анализ одного ядра (sn) с использованием замороженного гипофиза взрослых мышей 13 .Здесь мы успешно использовали аналогичную процедуру для характеристики всех основных типов клеток в гипофизе человека с особым акцентом на PSC. Заархивированные замороженные посмертных гипофизов детей, взрослых и пожилых людей (по одному мужчине и одной женщине на возрастную группу) были совместно проанализированы с помощью snRNAseq и snATACseq (sn multi-omics). Важно отметить, что мы также создали мультиомный набор данных гипофиза женского педиатрического возраста с одной и той же клеткой. Эти анализы позволили нам охарактеризовать ландшафты доступности транскриптома и хроматина типов клеток гипофиза.Мы дополнительно усовершенствовали идентификацию подтипов ПСХ человека и их изменений во время старения и предоставили информацию о разнообразных механизмах регуляции генов, лежащих в основе идентичности и детерминации стволовых клеток.

    Результаты

    Мультиомное профилирование Sn в гипофизе человека

    Для создания полногеномных карт экспрессии генов и открытого хроматина в гипофизе человека мы провели мультиомные анализы транскриптома sn (snRNAseq) в одном и том же образце. и доступность sn-хроматина (snATACseq) в замороженных посмертных гипофизах детей, взрослых и пожилых людей обоего пола, которые хранились в банках тканей при -80°C в среднем ~10 лет с момента донорства (диапазон от 4 до 20; Дополнительная таблица 1 ).Поскольку ядра, выделенные из одного и того же фрагмента гипофиза, обрабатывались как для snRNAseq, так и для snATACseq, парные наборы данных, хотя и не из одних и тех же ядер, были отобраны из одной и той же популяции ядер в каждом изучаемом гипофизе. Кроме того, для проверки тканевой гетерогенности и точности картирования типов клеток в разных анализах, а также для улучшения вывода о регуляторных механизмах оставшийся образец, включающий почти весь гипофиз одной женщины, был измельчен в порошок, а затем выделенные ядра были использованы для проведения: ) анализ sn-транскриптома и доступности sn-хроматина в одном и том же образце, b) мультиомный анализ sn в одной и той же клетке, обеспечивающий одновременное измерение экспрессии РНК и доступности хроматина в каждом отдельном ядре (рис.1а ).

    Рисунок 1: Схема эксперимента по определению типа клеток гипофиза человека

    a . Схема всего экспериментального рабочего процесса, от получения замороженных гипофизов до анализа данных sn. б . Схема, обобщающая интеграцию данных sn. Для каждого образца набор данных snATACseq (цветные точки UMAP) был интегрирован с набором данных snRNAseq (черные контуры UMAP) для создания интегрированного мультиомного наложения UMAP, идентифицирующего типы клеток. В UMAP типы ячеек имеют цветовую кодировку и обозначаются двух- или трехбуквенным кодом, как указано на нижней клавише.Образец женского гипофиза представлен в качестве примера. Все интегрированные образцы представлены на дополнительных рисунках. 1 и 2 . с. Схема сравнения парных анализов sn (мультиомики sn на одном и том же образце) ( i ) и анализа sn на мутиоме (одни и те же клетки) ( ii ). д. Мультиомный UMAP sn из одних и тех же клеток из женского педиатрического образца (см. Дополнительную таблицу 1 ).

    Все библиотеки snRNAseq и snATACseq, созданные из одних и тех же образцов, были объединены для секвенирования, чтобы уменьшить эффект партии.Данные, отвечающие порогу контроля качества (КК), были получены в общей сложности из 76 016 ядер для snRNAseq и 44 141 ядра для snATACseq в парных анализах, а также из 15 024 ядер в мультиомном анализе sn для одной и той же клетки ( Дополнительные таблицы 2 и 3 ). Для анализа данных данного образца, обработанного с помощью парных анализов sn в одном и том же образце, мы создали UMAP для наборов данных snATACseq и snRNAseq, каждый из которых идентифицировал кластеры клеток по типу ( рис. 1b, дополнительная рис. 1 ). Интеграция обоих наборов данных привела к наложению UMAP, показывающему хорошее соответствие основных типов клеток гипофиза в разных методах анализа (рис.1b, дополнительный рис. 2 ). Мультиомный анализ sn на одной и той же клетке, в котором каждая клетка давала наборы данных RNAseq и ATACseq (, рис. 1c, ), напрямую генерировала интегрированный график UMAP (, рис. 1d, ).

    Транскриптомный анализ типов клеток гипофиза человека

    Парные наборы данных snRNAseq для одного и того же образца имели в среднем 86% прочтений, сопоставленных с транскриптомом, и позволили обнаружить ~ 2800 генов на ядро ​​с сопоставимыми высококачественными показателями контроля качества. получено из всех образцов (, дополнительная таблица 2а, ).При анализе данных snRNAseq отдельных образцов мужского и женского гипофиза клетки были сгруппированы с использованием Seurat, визуализированы с использованием представления t-SNE (, дополнительная рис. 3, ), а также спроецированы на UMAP (, дополнительная рис. 1, ). Кластеры клеток аннотировали вручную, используя дифференциальную экспрессию РНК установленных маркерных генов гипофиза. Маркеры ключевых типов клеток включали FSHB , LHB и GNRHR для гонадотропов; Gh2 для соматотропов; POMC для кортикотропов; DIO2 для тиротропов 5, 14 ; PRL для лактотропов; и SOX9 10 , LGR4 15 и RBPMS 14 для PSC.Список установленных маркеров, используемых для присвоения каждого типа клеток, а также новых маркеров, идентифицированных в наших наборах данных, показан в дополнительной таблице 4 . Количество РНК (, дополнительная рис. 4, ), содержание митохондриальных генов (, дополнительная рис. 5, ) и содержание генов рибосомных белков (, дополнительная рис. 6, ) указывают на высокое качество данных snRNAseq, полученных от каждого человека. донор. Анализ кластеризации клеток выявил четко определенные кластеры клеток, включая пять основных типов клеток, продуцирующих гормоны, а также несколько типов неэндокринных клеток (, дополнительная рис.3 ).

    Анализ доступности хроматина типов клеток гипофиза человека

    Наборы данных snATACseq для парного анализа одного и того же образца позволили получить приблизительно 11 000 фрагментов ДНК на ядро ​​со средней оценкой обогащения по TSS 5,0 и долей прочтений в так называемых пиковых областях (FRiP) с оценкой 47 % ( Дополнительная таблица 2b ). Клетки были сгруппированы и визуализированы с использованием представления UMAP (, дополнительные рисунки 1,2, ). Кластеры клеток были вручную аннотированы на основе доступности хроматина (т.е. пики накопленных прочтений) на информативных промоторах среди тех же маркерных генов, которые использовались для аннотации RNAseq (см. Дополнительную таблицу 4 , Дополнительную рис. 7). Клетки Thyrotrope были слишком плохо представлены, чтобы генерировать надежные треки хроматина, что согласуется с их типом эндокринных клеток с наименьшим количеством в передней доле гипофиза 16 . Подобно результатам анализа транскриптома sn, кластеризация клеток данных snATACseq от каждого донора привела к отдельным кластерам клеток со всеми основными типами клеток, хотя тиротропный кластер не мог быть выделен во всех образцах самцов (, дополнительные рис.1,2 ).

    Идентификация типа клеток в наборах данных snRNAseq и snATACseq

    Интеграция данных snRNAseq и snATACseq из каждого образца была выполнена путем переноса метки из snRNAseq в данные snATACseq с использованием конвейера Seurat ( Дополнительные рисунки 1,2 ). Во всех отдельных образцах были обнаружены основные скопления клеток гипофиза. Некоторые кластеры демонстрировали градиент экспрессии и доступности хроматина, что приводило к их различению как отдельных кластеров, хотя они не были различимы физически (лактотропы на дополнительной рис.3d, кортикотропов в дополнительном рис. . 3b и , дополнительный рис. 1f ; соматотропы в Дополнительных рис. 3a, c, d и Дополнительный рис. 1d ; питуициты в дополнительных рис. 3e,f; гонадотропов в Дополнительных рис. 3a,d ).

    Чтобы улучшить разрешение типов клеток гипофиза человека и оценить индивидуальные различия, мы объединили наборы данных snRNAseq одного пола и пометили их цветом по донору ( Рис.2а,с ). Точно так же мы объединили данные snATACseq из образцов одного пола и пометили их донором (, рис. 2b,d, ). В дополнение к пяти типам эндокринных клеток гипофиза мы идентифицировали стволовые клетки, питуициты, а также перициты, эндотелиальные клетки и иммунные клетки (макрофаги, Т-клетки, В-клетки). Мы наблюдали гетерогенность от донора к донору в кластеризации типов клеток в обоих наборах данных. Например, у мужчин отдельные гонадотропные, соматотропные и лактотропные кластеры были отмечены как в данных RNAseq, так и в данных ATACseq, происходящих почти исключительно из педиатрической выборки.У женщин из педиатрического образца также были получены один гонадотропный, один соматотропный и один кластер стволовых клеток. Соотношения основных типов клеток гипофиза, идентифицированных snRNAseq по сравнению с snATACseq во всех образцах, были сильно коррелированы, что указывает на совпадение распределения основных типов клеток по двум методам анализа (R 2 > 0,96; рис. 2e ). Мы также наблюдали аналогичное распределение маркеров экспрессии в типах клеток гипофиза человека по сравнению с теми же маркерами в наборе данных гипофиза взрослых мышей ( 13 , , дополнительная рис.7 ). Набор мультиомных данных sn и парный набор данных sn той же выборки были созданы из измельченного педиатрического образца женского пола, что дополнительно подтвердило надежность определения типа клеток в двух анализах (, дополнительные таблицы 3, 5, ). Все наборы данных находятся в открытом доступе и доступны для изучения на сайте snpituitaryatlas.princeton.edu.

    Рисунок 2: Объединенный анализ гипофиза человека одного пола

    от н.э. до . Представление t-SNE экспрессии транскрипта sn ( a , самцы; c , самки) и доступности хроматина sn ( b , самцы; d , самки) в объединенных однополых образцах, с маркировкой возраст субъекта для каждого пола.Отдельные предметы имеют цветовую кодировку, как указано. Каждый кластер идентифицируется буквенным кодом, как указано в рис. 1 . Информация о донорах представлена ​​в дополнительной таблице 1 . e. Корреляция между пропорциями типов клеток, определенных snRNAseq, и snATACseq для всех образцов (самцов и самок). Строится линейная регрессия. Типы клеток гипофиза имеют цветовую кодировку, а ключ указан справа.

    Характеристика популяции ПСХ

    Стволовые клетки из всех образцов, идентифицированные с помощью snRNAseq ( Рис.2 ) были повторно кластеризованы с использованием конвейера Seurat, что привело к обнаружению 9 кластеров, 6 из которых не были хорошо разделены и образовали большую группу ( рис. 3a ). Три кластера, выделенные на рис. 3a , соответствовали стволовым клеткам-предшественникам, связанным с линией, каждый из которых отличался экспрессией POMC , POU1F1 и GATA3 соответственно (см. Обсуждение). Оставшаяся большая группа из 6 кластеров экспрессировала SOX2 , SOX9 и эффекторы пути Hippo WWTR1 (a.к.а. TAZ ) и YAP1 ( 17 и рассмотрено в 18 ; рис. 3d и дополнительный рис. 8 ), которые указывают на наивысшее выражение для некоторых незафиксированных PSC, с кластером 5 эти маркеры.

    Рисунок 3: Идентификация субкластеров стволовых клеток человека с помощью snRNAseq

    a . UMAP показывает идентификацию кластера стволовых клеток на основе данных snRNAseq из шести объединенных образцов человеческого гипофиза. Каждый кластер ячеек имеет цветовую кодировку и нумерацию.Стволовые клетки-предшественники, коммитированные по клону, обведены кружком. б . UMAP, идентифицирующие все субкластеры стволовых клеток с цветовой кодировкой у женщин и мужчин. На графике справа показана экспрессия XIST с выделением женских образцов. с . UMAP, идентифицирующие все субкластеры стволовых клеток с цветовой кодировкой у детей, взрослых и пожилых людей. д. Характеристические графики, изображающие распределение экспрессии генов-маркеров ключевых стволовых клеток и генов-маркеров коммитирования клеточных линий среди различных кластеров.Масштаб включен для каждого графика характеристик. Все шкалы аналогичны, за исключением POMC из-за экспрессии фонового гена. Графики дополнительных признаков генов представлены на дополнительной рис. 8 . е . Колокализация транскриптов Sox2 (красный) и Jun (синий) в гипофизе взрослых самцов мышей P56 CD-1 дикого типа. Шкала бара составляет 200 мкм. AL: передняя доля; IL: промежуточный лепесток; ПП: задняя доля гипофиза. Слева , полное изображение. Справа , увеличение рамочной области на левой панели.Стрелками отмечены конкретные клетки с колокализацией Sox2 и Jun . См. Дополнительный рис. 10 для совместной локализации Sox2 и Jun на P3 и P15. ф. Анализ экспрессии генов (графики в виде скрипки справа на каждом рисунке) и анализ доступности хроматина для SOX2 (слева ) и GATA3 (справа ) во всех типах клеток гипофиза из набора данных sn multiome, полученного от педиатрической женщины. Структура генов представлена ​​под дорожками.

    Затем мы исследовали взаимосвязь кластеров PSC с полом и возрастом доноров ( Рис. 3b,c ). Кластеры незафиксированных стволовых клеток были в значительной степени разделены в образцах каждого пола, что подтверждается экспрессией специфичных для женщин XIST 19 . Когда наборы данных мужчин и женщин были сгруппированы по возрасту, все подтипы ПСХ были представлены во всех изученных возрастах. Распределение РНК-маркеров для прогениторных и коммитирующих стволовых клеток показано на рис.3д . Канонические маркеры стволовых клеток SOX2 и SOX9 , а также гены, ранее участвующие в регуляции стволовых клеток гипофиза (например, WWTR1 , PITX2 и LGR4 ; для обзора см. 18). выражено. Интересно, что экспрессия JUN и JUND , которые участвуют в регуляции стволовости в других тканях 20, 21 , была гетерогенной, с самой высокой экспрессией, связанной с кластерами, которые преобладали в мужских образцах.

    Мы также сравнили паттерны экспрессии маркерных генов в PSC человека и мыши. Как и ожидалось, мы обнаружили Sox2 , Sox9 , Wwtr1 и Yap1 в популяции стволовых клеток обоих видов ( рис. 3d; дополнительные рис. 8,9 ). Экспрессия POU1F1 в образцах человека была обнаружена в пропорции клеток в основном кластере PSC, что указывает на коммитирующих предшественников среди этой популяции, как это видно для Pou1f1 у мышей и аналогично для PAX7/Pax7 (детерминанта промежуточная доля и меланотропная идентичность; 22 ).Дополнительные маркеры, о которых ранее сообщалось в стволовых клетках гипофиза мышей или которые были связаны со стволовыми клетками, также были обнаружены в стволовых клетках человека, включая WIFI 23, 24 , HES1 , NOTCh3 18 , 906 90 3AD4 6 25 и SMAD5 26, 27 (дополнительный рис. 8 ).

    JUN , который экспрессировался в незафиксированных PSC, преимущественно мужских PSC, не был предложен в качестве маркера PSC, но ранее сообщалось, что он обогащен SOX2-позитивными клетками посредством группового секвенирования у мышей 15 .Поэтому мы исследовали, проявляет ли Jun коэкспрессию с маркером стволовых клеток Sox2 путем гибридизации in situ в гипофизе новорожденных, молодых самцов и взрослых самцов мышей. Этот анализ подтвердил, что Jun является маркером стволовых клеток путем выявления двойной маркировки Jun-Sox2 в образцах всех возрастов (, рис. 3e, и , дополнительный рис. 10, ). В целом, характеристика гетерогенности популяции PSC человека и мыши подтверждает существование различных подтипов некоммитированных стволовых клеток, которые отличаются от ранних коммитирующих клонов (см. 28).

    Получение данных snRNAseq и snATACseq из одних и тех же образцов обеспечивает анализ с высоким разрешением паттерна доступности хроматина ключевых генов в каждом типе клеток гипофиза и выявляет потенциальные новые регуляторные домены (см. 13 ). На рис. 3f показаны специфичная для типа клеток экспрессия генов и доступность хроматина по типам клеток для маркера стволовости SOX2 и предполагаемого маркера гонадотропной/тиротропной коммитирующей клеточной линии GATA3.SOX2 экспрессировался в стволовых клетках и питуицитах, которые показали самую высокую доступность промотора. GATA3 экспрессировался в гонадотропах и тиреотропах в дополнение к коммитирующей линии стволовых клеток. Все три типа клеток также показали большую доступность хроматина в области промотора GATA3 . Другие предполагаемые цис-регуляторные домены SOX2 и GATA3 демонстрируют повышенную доступность в типах клеток, проявляющих экспрессию.В последующем разделе мы дополнительно разъясняем регуляторный контроль этих и дополнительных ключевых маркеров PSC путем моделирования мультиомных данных sn для одной и той же клетки.

    Разнообразие эпигенетических программ ПСХ

    Затем мы изучили скоординированную экспрессию генов и программы доступности хроматина в ПСХ. Мы использовали структуру извлечения информации на уровне пути (PLIER), которая деконволюцирует наборы данных в наборы генов латентной переменной (LV) с использованием известных путей, не обеспечивая при этом строгой ортогональности, необходимой для анализа основных компонентов 29 .Эти анализы PLIER идентифицировали LV доступности как РНК, так и хроматина, которые преимущественно экспрессировались в каждом основном типе клеток гипофиза ( Supplementary Figs. 11,12 ). Одна РНК LV была специфичной для стволовых клеток и высоко экспрессировалась у представителей обоих полов во всех возрастных группах (, рис. 4a, для 30 основных генов и , рис. 4b, для 200 основных генов). Проекция этого PSC LV на данные snRNAseq гипофиза взрослой мыши 13 показала сохранение этой программы транскриптома PSC у мыши ( Fig.4с ). Чтобы определить, была ли эта программа также связана с измененной структурой хроматина в PSC, мы спроецировали этот LV на данные snATACseq человека, используя сигналы доступности промотора в качестве признаков гена. Эта проекция показала, что программа транскриптома LV была связана с повышенной доступностью хроматина на промоторах соответствующих генов (, рис. 4d, ). Анализ данных snATACseq выявил ряд в значительной степени различных программ доступности, каждая из которых наиболее сильно активировалась у субъектов разного возраста или пола (, дополнительная рис.12 ). Сложность программ хроматина PSC, идентифицированная в этом анализе, может быть связана с разнообразием доноров (см. Обсуждение).

    Рисунок 4: Характеристика скоординированной экспрессии генов и программ доступности хроматина в клетках гипофиза человека типов

    a, b . Тепловая карта уровней экспрессии генов для верхнего PSC LV человека (LVsc РНК ) для каждого типа клеток и донора, 30 лучших генов показаны на ( a ) и 200 лучших генов на ( b ).Каждый образец гипофиза указан вверху. На шкале красный цвет означает самый высокий уровень экспрессии РНК или доступность хроматина. Pd, детский; Объявление, взрослый; Ag, старый гипофиз. с. Тепловая карта, показывающая 200 лучших генов, связанных с LVsc человека РНК , примененных к набору данных snRNAseq мыши 13 . д. Тепловая карта, показывающая 200 лучших генов, связанных с LVsc человека РНК , примененных к наборам данных snATACseq человека. ( a , b , c , d) Тип ячейки и цветовое кодирование предмета указаны на нижней клавише.См. дополнительную таблицу 1 для получения информации о донорах. Дополнительные анализы ЛЖ представлены на дополнительных рисунках. 11 и 12 .

    Помимо LV, специфичных для типа клеток, мы также идентифицировали один LV доступности хроматина, проявляющий значительно большую активность с увеличением возраста донора (LVage atac ). Показанный в рис. 4e представляет собой тепловую карту 30 промоторов с наибольшим весом, содержащих этот LV, в каждом образце по типу клеток. Когда уровень активности в каждом типе клеток был построен отдельно для возрастного диапазона, изученного в разбивке по полу, мы обнаружили, что все типы клеток показали увеличение доступности этих промоторов с возрастом, особенно между образцами детей и взрослых (90–299 рис.5а ). Примечательно, что увеличение доступности в ПСК было менее выраженным у женщин, тогда как у мужчин почти не наблюдалось изменений (розовые линии на 90–299 рис. 5а 90–300). Эти результаты позволяют предположить, что эта программа доступности представляет собой возрастные скоординированные изменения, которые более выражен в дифференцированных клетках, чем в ПСК.

    Рисунок 5: Ассоциированная с возрастом доступность хроматина и анализ псевдовременной траектории транскриптома

    a. Тепловая карта, показывающая уровни доступности хроматина 30 основных генов в возрастном LV человека (LVage atac ).Тип ячейки и цветовое кодирование субъекта указаны на нижней части Рис. 4 . См. дополнительную таблицу 1 для получения информации о донорах. Дополнительные анализы ЛЖ представлены на дополнительных рисунках. 11 и 12 . б. График, показывающий общие изменения доступности хроматина для всех типов клеток гипофиза с возрастом у женщин ( слева ) и мужчин ( справа ). Типы клеток гипофиза имеют цветовую кодировку. Те же типы клеток связаны с линиями по возрасту испытуемых. с . UMAP показывает траекторию внутри кластера стволовых клеток с образцами, кодированными по возрасту для женских ( Верхний ) и мужских ( Нижний ) образцов. д. Псевдовременной анализ траектории для женских ( Верхний ) и мужских ( Нижний ) образцов. Траектории от каждой начальной точки ведут к более старым образцам. Цветовая шкала показана для псевдовременных траекторий. э. генных модулей, идентифицированных с помощью псевдовремени и демонстрирующих возрастные изменения.Monocle 3 идентифицировал группы генов, которые изменяются в зависимости от псевдовремени для каждого пола. Гены переменной траектории были сгруппированы в модули, которые затем были нанесены на тепловую карту, чтобы показать относительную экспрессию каждого модуля гена в пределах пола в каждой возрастной группе. Помечены 4 наиболее обогащенных модуля для каждой возрастной группы, при этом модуль 1 является наиболее обогащенным для каждого возраста. Pd1-4 указывает на первые 4 модуля для детей, Ad1-4 представляет расширенные модули для взрослых, а Ag1-4 обозначает 4 лучших модуля для пожилых образцов.Сине-красный цвет на цветовой шкале представляет низкие-высокие относительные уровни экспрессии (z-преобразованная средняя экспрессия) генных модулей. См. Дополнительный рисунок 13 для выбранных траекторий генов в определенных модулях. См. дополнительную таблицу 6 для получения информации о лучших генах в модулях.

    Для дальнейшего изучения взаимосвязи транскриптомов PSC в образцах разного возраста мы построили псевдовременную траекторию из наборов данных snRNAseq однополых животных с использованием алгоритма Monocle 30 ( рис.5б,с ). У женщин, как и у мужчин, в качестве корня траектории была выбрана область графика, наиболее плотно занятая педиатрическими ПСК. У обоих полов детские ПСХ составляли самую большую группу, которая отделялась от взрослых и старческих ПСХ. Это разделение показывает большие различия между транскриптомами PSC из детских и взрослых образцов, а также предполагает, что мы не захватили все переходные стадии стволовых клеток в проанализированных образцах. Чтобы определить наборы генов, которые динамически регулируются по мере продвижения клеток по траектории, мы идентифицировали несколько коррелирующих генных модулей для каждой возрастной группы у женщин и у мужчин (90–299 рис.5д ). Верхние гены в наиболее значимых модулях и траектории выбранных генов показаны в дополнительной таблице 6 и дополнительной рис. 13 соответственно. Примечательно, что почти ни один из транскриптов, определяющих модуль, ранее не сообщался в качестве маркеров ПСХ, и их роль в физиологии ПСХ на протяжении жизни неизвестна. В целом, эти анализы показывают относительную стабильность, связанную со старением программу хроматина в ПСХ и динамические изменения в транскриптоме ПСХ с возрастом.

    Фактор транскрипции и механизмы эпигенетического контроля генов PSC

    Используя наборы данных snRNAseq и snATACseq, полученные из одних и тех же гипофизов мышей, мы недавно сообщили, что доступность хроматина является ключевой детерминантой программ транскрипции клеточных типов 13 . По сравнению с наборами данных той же выборки, мультиомные данные sn той же клетки обладают значительно большей статистической силой для вывода о регуляторных механизмах, лежащих в основе экспрессии специфических генов 31, 32 .Согласованные данные о доступности транскриптома и хроматина в мультиомных анализах sn в одних и тех же клетках позволяют моделировать ковариацию доступности хроматина и экспрессии генов в тысячах отдельных клеток. Кроме того, не все клетки одного типа экспрессируют одни и те же транскрипты. Данные мультиома sn на одних и тех же клетках впервые могут дать представление о факторах транскрипции (TF) и эпигенетических механизмах, которые формируют гетерогенную экспрессию генов в пределах одного и того же типа клеток гипофиза.

    Чтобы изучить роль изменений в экспрессии TF и ​​состоянии хроматина в модулировании ключевых генов PSC, мы применили вычислительную основу линейного моделирования к 15 024 ядрам в наборе мультиомных данных sn для одних и тех же клеток, полученных из гипофиза женской девочки. Для каждого гена-мишени линейная модель выбирает потенциальные цис-регуляторные области, содержащие пики промотора ATAC, а также совместно доступные дистальные пики. Затем, проверяя совместную экспрессию предполагаемых транс-действующих регуляторных факторов, которые предсказывают сайты связывания TF в кодоступных областях, линейная регрессия идентифицирует TF и ​​области хроматина, которые наиболее достоверно предсказывают экспрессию гена-мишени.Линейная модель, используемая для анализа всех клеток гипофиза (анализ «пангипофизарных клеток»), может сделать вывод о механизмах и факторах, участвующих в специфической экспрессии клеток. Когда анализируются только клетки, содержащие один тип клеток гипофиза, линейная модель может генерировать гипотезы о механизмах, ответственных за дифференциальную экспрессию среди разных клеток, составляющих эту линию.

    Сначала мы проанализировали маркеры коммитированных предшественников POMC , POU1F1 , TBX19 и NR5A1 .Выход конвейера линейной модели представляет собой p-значение, при котором каждая выбранная цис-регуляторная область и каждый отдельный TF с сайтами в этой области способствуют экспрессии целевого гена (, дополнительные рисунки 14-17, ). TF, способствующие специфичной для типа клеток экспрессии этих маркерных генов с использованием анализа пангипофизарных клеток, включали многие факторы, которые ранее были вовлечены в дифференцировку коммитирующих стволовых клеток. Например, анализ POMC идентифицировал TBX19, который является индуктором POMC-экспрессирующей линии кортикотропа/меланотропа и экспрессии POMC 33 . TCF7L2 , который был очень значим в анализах POU1F1 и TBX19 , является эффектором сигнального пути WNT, который регулирует рост и развитие гипофиза 34 . Аналогично, LEF1 , другой медиатор передачи сигналов WNT (см. 35 ), также был идентифицирован в анализе TBX19 . ESR1 (рецептор эстрогена альфа) был наиболее значимым TF, вовлеченным в экспрессию NR5A1 . В соответствии с этим открытием, недавнее исследование мышиных гонадотропных клеточных линий продемонстрировало, что эстроген-зависимое связывание этого ядерного рецептора с недавно идентифицированной энхансерной областью запускает экспрессию Nr5a1 во время спецификации линии гонадотропных клонов 36 .Высокая значимость, полученная в анализе линейной модели для регуляторов транскрипции, о которых сообщалось в предыдущих исследованиях, предполагает, что новые кандидаты, которые мы идентифицировали, заслуживают рассмотрения для будущих исследований. Например, TF, показывающий второе место в анализе пангипофизарных клеток POMC , представляет собой MNX1, важный ген гомеобокса, ранее вовлеченный в развитие моторных нейронов, поджелудочной железы и лимфоидных клеток 37, 38, 39 . Таким образом, MNX1 является интригующим новым кандидатом в регуляторы транскрипции в приверженности кортикотропным/меланотропным клонам.В дополнение к идентификации новых предполагаемых регуляторов TF, применительно ко всем клеткам гипофиза, модель также определяет проксимальные и дистальные регуляторные участки, в значительной степени связанные с экспрессией гена-мишени в типах клеток, экспрессирующих этот ген. Эти анализы идентифицируют ранее неисследованные регуляторные домены в этих ключевых генах ПСХ, которые демонстрируют доступность, связанную с экспрессией генов, и, следовательно, являются кандидатами в цис-регуляторные домены (, рис. 6, и , дополнительные рис.14-18 ).

    Рисунок 6: Линейная модель, предсказывающая механизмы доступности хроматина и TF, способствующие экспрессии генов PSC

    a . Анализ линейного моделирования всех клеток гипофиза («пангипофизарная клетка») позволяет сделать вывод о доступности хроматина и TF, участвующих в специфичной для стволовых клеток экспрессии SOX2 ( слева , верхняя дорожка представляет собой вклад каждого пика в экспрессию гена, измеренный с помощью — log(P-значение), а нижние дорожки — сайты связывания ТФ). Индивидуальный вклад каждого предсказанного TF в выражение SOX2 показан как -log (значения P, Right ) См. Дополнительный рисунок .18 для анализа SOX2 только в стволовых клетках. б . Анализ пангипофизарных клеток позволяет сделать вывод о доступности хроматина и TF, участвующих в специфичной для стволовых клеток экспрессии GATA3 ( Top , верхняя дорожка представляет собой вклад каждого пика в экспрессию гена, измеренную с помощью -log (значение P), а нижние дорожки являются сайтами связывания ТФ). Индивидуальный вклад каждого предсказанного TF в экспрессию GATA3 показан как -log(P-values) ( Right ) c .Анализ линейного моделирования в стволовых клетках делает вывод только о доступности хроматина и TF, участвующих в дифференциальной экспрессии экспрессии GATA3 в популяции стволовых клеток. Прогнозируется, что никакие TF не будут способствовать экспрессии GATA3 в стволовых клетках. д . Анализ линейного моделирования в стволовых клетках делает вывод только о доступности хроматина и TF, участвующих в дифференциальной экспрессии экспрессии POMC ( слева , верхняя дорожка представляет собой вклад каждого пика в экспрессию гена, измеренный как -log (значение P), а нижние дорожки — сайты связывания ТФ).Индивидуальный вклад каждого предсказанного TF в выражение POMC показан как log (P-значения) ( Right ). См. Дополнительный рисунок 17 для анализа пангипофизарных клеток экспрессии POMC .

    Затем мы изучили маркер стволовости SOX2 и маркер линии коммитирующих клеток GATA3 . Когда были исследованы все клетки гипофиза, экспрессия SOX2 в пределах всего подтипа стволовых клеток была связана с высокозначимыми совместно доступными проксимальными, вышестоящими и нижестоящими регуляторными доменами (рис.6а, Левый ), а также экспрессию ТФ, картирующихся в эти домены ( Рис. 6а, Правый ). Эти результаты показывают, что специфичная для PSC экспрессия SOX2 зависит от характера доступности хроматина регуляторных доменов, присутствующих в этих клетках, а также от экспрессии необходимых регуляторных факторов, взаимодействующих с этими доменами. Противоположный результат был получен при применении линейной модели только к PSC, чтобы сделать вывод о регуляторных цепях, участвующих в гетерогенной экспрессии SOX2 внутри PSC.В этом анализе цис-регуляторные домены плохо коррелировали с экспрессией SOX2 (, дополнительная рис. 18, , левая, ), и ограниченный набор регуляторных факторов (, дополнительная рис. 18, , , правая, ) был вовлечен в гетерогенный паттерн экспрессии SOX2 в PSCs. Эти результаты свидетельствуют о том, что структура хроматина достаточна для экспрессии SOX2 во всех PSC, а экспрессия в конкретных PSC зависит от экспрессии ключевых регуляторных TF.При проведении анализа пангипофизарных клеток для GATA3 мы наблюдали картину, согласующуюся с таковой для SOX2 , при этом как структура хроматина, так и экспрессия регуляторного фактора отвечали за экспрессию в PSC ( рис. 6b , Left , Рис. 6b , Правый ). Однако, в отличие от SOX2 , гетерогенная экспрессия GATA3 в PSC была связана с цис-регуляторными доменами доступности хроматина, но не с экспрессией специфических регуляторных факторов ( Fig.6с ). Эти результаты позволяют предположить, что регуляторные белки, необходимые для экспрессии GATA3 в ПСК, экспрессировались во всех клетках, а гетерогенный паттерн экспрессии в ПСК определялся различиями в доступности хроматина регуляторных доменов между GATA3 -экспрессирующими и неэкспрессирующими PSC. Когда POMC анализировали только в PSC, наиболее значимыми выявленными TF были E2F4 40 и TBX19, в то время как совместно доступные регуляторные области имели низкую значимость ( Fig.6д ). Эти результаты предполагают, что дифференциальная экспрессия POMC в коммитированных PSC по сравнению с некоммитированными PSC в большей степени связана с экспрессией этих ключевых TF, чем с изменениями доступности хроматина в ключевых регуляторных областях.

    Обсуждение

    Мы создали высококачественные наборы данных snRNAseq и snATACseq из отдельных гипофизов человека, продемонстрировав осуществимость профилирования sn в замороженных посмертных образцах , которые хранились при -80 C в течение двух десятилетий.Анализ этих данных дает представление о гетерогенности ПСХ и регуляторных механизмах и цепях, лежащих в основе экспрессии ключевых генов ПСХ. Мы различаем и характеризуем некоммитированные и коммитирующие линии стволовых клеток, различия, связанные с возрастом и полом доноров, и предлагаем различные механизмы, ответственные за экспрессию ключевых маркеров ПСХ.

    Рекластеризация стволовых клеток, идентифицированных с помощью анализа данных snRNAseq, позволяет выделить три кластера, соответствующие коммитирующим стволовым клеткам (см.3а ). Кластер , экспрессирующий РОМС , вероятно, является предшественником кортикотропных/меланотропных линий 41 . Другой кластер, экспрессирующий POU1F1 , представляет PSCs с потенциалом связываться с линиями соматотропов, лактотропов и тиротропов 42 . Кластер, экспрессирующий GATA3 , предположительно включает клетки, которые коммитируются в гонадотропную линию, хотя низкая экспрессия NR5A1 препятствует окончательному отнесению линии клеточного типа, поскольку GATA3 также сообщается в тиротропах ( Supplementary Fig.8 ) 43 . Все три передающие линии были идентифицированы у обоих полов. Некоммитированные стволовые клетки, которые сформировали шесть кластеров, которые не были четко разделены, по большей части не перекрывались в мужских и женских образцах.

    Наш анализ идентифицирует транскриптомные и эпигенетические программы ПСХ, а также возрастные различия в ПСХ. Мы идентифицируем одну программу RNAseq PSC LV, которая хорошо экспрессируется во всех проанализированных образцах, сохраняется у мышей и связана с PSC-специфическими изменениями хроматина в промоторах для генов, составляющих этот LV.Мы также идентифицировали ATACseq LV, который проявляет повышенную доступность с возрастом во всех типах клеток гипофиза, но показывает меньшие изменения с возрастом в PSC. Когда данные snRNAseq были проанализированы по траектории, PSC из детских образцов были отделены от взрослых и старых образцов обоих полов. Мы обнаружили, что PSC человека и мыши имеют схожие паттерны генной экспрессии и характеризуются наличием нескольких подтипов некоммитированных и коммитированных клеток, что указывает на высокую степень консервации этого типа клеток во время эволюции.Однако идентификация видоспецифичных генов может означать межвидовые или возрастные различия с потенциальными последствиями для использования мышиной модели для разработки терапии.

    Программы PSC LV и полное разделение PSC разных возрастов в анализе траектории указывают на то, что полная характеристика изменений в транскрипционных и эпигенетических программах PSC при старении потребует анализа дополнительных образцов в течение возрастного диапазона. В совокупности наши данные свидетельствуют о том, что пол и возраст влияют на несколько биологических процессов в стволовых клетках.Необходимо дополнительное исследование для дальнейшего выяснения половых и возрастных различий, которые, вероятно, окажут значительное влияние на разработку новых методов лечения на основе стволовых клеток.

    Сгенерированные наборы данных охватывают все основные типы клеток гипофиза человека. Надежность идентификации всех основных типов клеток в одном образце наборов данных snRNAseq и snATACseq для представителей обоих полов и различных возрастов подтверждается соответствием соотношений типов клеток, полученных в обоих анализах, и подтверждением идентификации типа клеток в мультиомные данные sn той же ячейки.Мы сообщаем о LV экспрессии генов и доступности хроматина, которые характерны для каждого основного типа клеток гипофиза. Обширные данные о женском педиатрическом гипофизе предоставлены несколькими наборами данных с одним и тем же образцом и большим набором данных sn мультиома с одними и теми же клетками. Эти данные представляют собой ресурс для решения вопросов о характеристике и регуляторных механизмах любого типа клеток в гипофизе человека.

    Выводы из набора мультиомных данных sn для одних и тех же клеток с использованием линейной модели дают представление о TF и ​​доступных участках хроматина, способствующих экспрессии ключевых генов PSC.Модель также дает представление об общих механизмах (экспрессия TF, различия в доступности хроматина или и то, и другое), ответственных за дифференциальную экспрессию генов-мишеней PSC среди разных клеток. Поскольку модель основана на обнаружении корреляции регуляторных признаков с экспрессией гена-мишени, результаты, полученные при анализе генов ПСХ среди всех клеток гипофиза, представляют механизмы, участвующие в экспрессии гена-мишени в ПСХ по сравнению с другими типами клеток. Когда модель применяется только к PSC, результаты представляют собой гипотезы о дифференциальной экспрессии этих генов-мишеней в подмножестве PSC.Для PSC и проанализированных маркеров коммитированных предшественников ( POMC , POU1F1 , TBX19 , NR5A1 , SOX2 и GATA3 ) идентифицированы множественные сайты связывания с доступными хроматиновыми сайтами с доступными сайтами TF. высокая вероятность того, что они способствуют экспрессии этих маркеров стволовыми клетками по сравнению с другими типами клеток. Это поддерживает формулировку, согласно которой экспрессия каждого из этих маркеров в PSCs зависит от эпигенетического ремоделирования хроматина, а также от экспрессии ключевых TF, которые необходимы для запуска экспрессии генов.

    Анализ мультиомных данных sn в одних и тех же клетках гипофиза женщин у детей позволяет предположить, что разнообразие механизмов способствует дифференциальной экспрессии маркерных генов среди ПСХ. Что касается дифференциальной экспрессии маркеров PSC внутри PSC, NR5A1 и POU1F1 демонстрируют TF и ​​сайты хроматина, связанные с гетерогенной экспрессией. POMC , TBX19 и SOX2 связаны с экспрессией специфических ТФ, а GATA3 с доступностью специфических регуляторных сайтов.Пангипофизарный анализ показывает важность как экспрессии TF, так и структуры хроматина в экспрессии ключевых генов PSC. Однако эти анализы гетерогенной экспрессии в пределах PSC предполагают, что дифференциальная экспрессия некоторых маркеров преимущественно определяется экспрессией ключевых TF в этих клетках, тогда как дифференциальная экспрессия других маркеров зависит от гетерогенности в структуре хроматина.

    Сильной стороной этого исследования является мультиомное профилирование всего гипофиза на постнатальных стадиях, которое мы используем для разработки карты изменчивости ПСХ между полами, а также в процессе развития и старения.Кроме того, насколько нам известно, это первое исследование, посвященное профилированию PSC человека в процессе старения и предлагающее механизмы дифференциальной экспрессии маркерных генов в клетках одного и того же типа. Мы демонстрируем возможности мультиомного анализа одних и тех же образцов и одних и тех же клеток для дальнейшего выяснения механизмов, лежащих в основе типа клеток PSC и состояния клеток у обоих полов и в течение всего возрастного периода.

    Методы

    Получение образцов

    Быстрая заморозка после смерти человеческих гипофизов были получены из NeuroBioBank Национального института здравоохранения (NIH) и хранились при температуре -80°C до обработки.См. Дополнительную таблицу 1 для получения информации о поле субъекта, возрасте, этнической принадлежности, посмертном интервале (PMI), причине смерти и году сбора. Полученные ткани варьировали от целых до кусочков гипофиза. Все образцы были получены от умерших особей. Анонимность донора была сохранена, и соблюдались руководящие принципы в отношении согласия, защиты людей и конфиденциальности донора.

    Выделение ядер из гипофиза

    Для выделения ядер были испытаны два метода.Замороженные посмертных человеческих гипофизов были либо: 1) разбиты на мелкие кусочки в замороженной ступке на сухом льду, и один кусок был разморожен на льду и подготовлен для извлечения ядер на основе модифицированного протокола из 44 , или 2 ) измельчают и часть порошка используют для выделения ядер. Остаток гипофиза хранили при температуре -80°С. Вкратце, и все это на льду, ингибитор РНКазы (NEB кат. № MO314L) добавляли к буферу для гомогенизации (0,32 М сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 5 мМ CaCl 2 , 3 мМ Mg(Ac) 2 , 0,1 % IGEPAL CA-630), 50 % OptiPrep (запас составляет 60 % среды от Sigma; кат. № D1556), 35 % OptiPrep и 30 % OptiPrep справа перед изоляцией. Каждый гипофиз гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Даунса (1 мл, номер по каталогу VWR 71000-514) и гомогенат фильтровали через 40-мм сетчатый фильтр. Добавляли равный объем 50% OptiPrep и градиент центрифугировали (ротор SW41 при 17 792xg; 4°C; 25 мин). Ядра собирали из интерфазы, промывали, ресуспендировали либо в 1X буфере для разведения ядер для snATACseq (10X Genomics), либо в 1X PBS/0.04% BSA для snRNAseq и подсчитывали (Cellometer).

    Анализ SnRNAseq

    SnRNAseq выполняли в соответствии с Руководством пользователя наборов одноклеточных 3’-реагентов V3 (10x Genomics, Плезантон, Калифорния). Ядра фильтровали и подсчитывали на приборе Countess. Было выбрано не менее 1000 ядер (Chromium Single Cell 3’ Chip kit A v2 PN-12036 или v3 chip kit B PN-2000060). Обратная транскрипция (ОТ) выполнялась в эмульсии, амплифицированной кДНК и библиотеках, сконструированных с помощью химии v3.Библиотеки были проиндексированы для мультиплексирования (комплект Chromium i7 Multiplex PN-12062).

    Анализ данных SnRNAseq

    Данные SnRNAseq были обработаны с использованием конвейера Cell Ranger версии 5.0.0 и сопоставлены с эталонным геномом Cell Ranger GRCh48, включая интроны. Анализ кластеризации и дифференциальной экспрессии генов проводили с использованием Seurat v.3.9.9.9024 и стандартных процедур 45, 46 . Лучшие маркеры для каждого кластера сравнивали с известными маркерами типов клеток гипофиза, чтобы аннотировать кластеры; список наиболее распространенных генов, связанных с каждым типом клеток, приведен в дополнительной таблице 4 .

    Мы использовали проекцию t-SNE для выявления наиболее распространенных дублетов перекрестного типа, а также апоптотических клеток и клеток с малым количеством клеток, поскольку t-SNE сохраняет локальную структуру данных лучше, чем проекция UMAP. Скопления дублетов выглядят как маленькие спутники с большим количеством UMI по отношению к основным скоплениям. Мы проверили природу каждой такой группы клеточных штрих-кодов, построив график экспрессии их генов маркеров верхнего типа клеток. Изучив, какие две программы экспрессии генов выражены в штрих-кодах, составляющих каждый из этих сателлитных кластеров, мы смогли идентифицировать два типа клеток, которые составляют штрих-коды этих субкластеров.

    Апоптотические клетки образуют свои собственные кластеры отдельно от родительского кластера. Несколько типов клеток часто сливаются в один апоптотический кластер, так что не каждый тип клеток будет иметь соответствующий апоптотический кластер. Эти клетки характеризуются низким количеством UMI и почти исключительно сплайсированными считываниями мРНК, что предполагает конденсацию ядер и остановку транскрипции новой мРНК.

    Некоторые кластеры сотового типа имеют ответвления, состоящие из штрих-кодов с низким количеством UMI. В отличие от апоптотических кластеров, они имеют такое же соотношение интронных и экзонных прочтений, как и их родительский кластер, и не образуют свой собственный кластер, но обычно соединяются со своим родительским кластером или кажутся очень близкими к нему.Вероятно, это экспериментальные артефакты медленного захвата мРНК. Их программа экспрессии генов такая же, как и у их собратьев с более высоким уровнем UMI, но они более неблагоприятно страдают от отсева. Таким образом, мы решили удалить эти ответвления с низким UMI из последующего анализа вместе с дублетными штрих-кодами и апоптозными клетками. Анализ

    SnATACseq

    SnATACseq выполняли в соответствии с Руководством пользователя Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits V1 (10x Genomics, Плезантон, Калифорния). Ядра подсчитывали (счетчик Countess), транспозицию выполняли в 10 мкл при 37°C в течение 60 минут по меньшей мере на 1000 ядер-мишеней перед загрузкой Chromium Chip E (PN-2000121).Штрихкодирование проводили в эмульсии (12 циклов) по протоколу Chromium. Библиотеки были проиндексированы для мультиплексирования (Chromium i7 Sample Index N, Set A kit PN-3000262).

    Анализ SnATACseq

    Данные SnATACseq были обработаны с использованием конвейера Cell Ranger-ATAC версии 1.2.0 и сопоставлены с эталонным геномом Cell Ranger-ATAC GRCh48. Кластеризация проводилась с использованием версий Seurat/Signac 3.1.5/0.2.4 и стандартных процедур 47 . Мы создали треки доступности хроматина вокруг известных маркерных генов типа клеток гипофиза и искали доступность промотора этих генов для аннотирования кластеров.

    Дублеты, малочисленные и апоптотические клетки идентифицировали так же, как и для данных snRNAseq, за исключением того, что для данных ATAC проекция UMAP работает лучше и вместо нее используется. Мы использовали количество фрагментов в пиках в качестве индикатора того, была ли клетка здоровой, дублетной или малочисленной/апоптотической. Дублеты были проверены на наличие фрагментов в пиках, ассоциированных с основными маркерами обоих типов клеток. В целом, в данных ATAC у нас гораздо меньше штрих-кодов ячеек, поэтому дублеты также встречаются реже.Следовательно, было идентифицировано несколько кластеров дублетов.

    Мультиомный анализ Sn

    Мультиомный анализ Sn выполняли в соответствии с Руководством пользователя Chromium Single Cell Multiome ATAC и наборами реагентов для экспрессии генов V1 (10x Genomics, Плезантон, Калифорния) на части измельченного детского женского образца. Ядра подсчитывали (счетчик Countess), транспозицию выполняли в 10 мкл при 37°C в течение 60 минут, нацеливаясь на 10000 ядер, перед загрузкой Chromium Chip J (PN-2000264) для генерации GEM и штрих-кодирования.После очистки после GEM библиотеки были предварительно амплифицированы с помощью ПЦР, после чего образец был разделен на три части: одна часть для создания библиотеки snRNAseq, одна часть для библиотеки snATACseq, а остальная часть хранилась при -20°C. Библиотеки SnATAC и snRNA индексировали для мультиплексирования (Chromium i7 Sample Index N, Set A kit PN-3000262 и Chromium i7 Sample Index TT, Set A kit PN-3000431 соответственно).

    Мультиомный анализ Sn

    Мы проанализировали детский женский образец с помощью мультиомного sn.Мы объединили библиотеки из обеих лунок GEM и запустили конвейер Cell Ranger ARC 1.0.0 для объединенного образца в соответствии с рекомендациями 10x Genomics. Запуск конвейера на каждой лунке GEM отдельно показывает, что образцы имеют 97 общих штрих-кодов, которые называются ячейками.

    Мы использовали Seurat версии 3.9.9.9024 с Signac версии 1.1.0 для выполнения нашего кластерного анализа с использованием подхода взвешенного общего графа ближайших соседей. Этот метод идентифицирует для каждой клетки ее ближайших соседей на основе взвешенной комбинации двух модальностей (экспрессия генов и доступность хроматина).Аналогичным образом мы используем взвешенный граф ближайших соседей для получения UMAP-проекции данных. Модальность экспрессии гена использовалась для идентификации типов кластерных клеток после определения основных маркеров для каждого кластера.

    Апоптотические, малочисленные клетки и дублеты также идентифицировали способом, аналогичным методу данных snRNAseq. Как апоптотические клетки, так и клетки с низким количеством клеток были идентифицированы как имеющие гораздо более низкие значения как количества их транскриптов, так и количества их фрагментов, перекрывающих пики ATAC.Кроме того, апоптотические клетки имеют большую долю транскриптов митохондриальных генов, тогда как в малочисленных клеточных транскриптах преобладают фоновые гены. Дублеты, с другой стороны, были идентифицированы как имеющие более высокое количество как в РНК, так и в ATAC, и экспрессирующие генные программы двух типов клеток одновременно. Только один из основных кластеров был идентифицирован как дублет, и дальнейшая подкластеризация не предпринималась.

    Анализ объединенных наборов данных

    Все выборки мужчин и женщин были объединены по полу в Seurat на уровне подсчета UMI, и весь кластерный анализ был повторен для объединенных выборок независимо с самого начала.Мы следовали тем же шагам анализа, что и для отдельных образцов. В отличие от наших интегрированных сэмплов (см. следующий раздел), с объединенных семплов не удаляются пакетные эффекты. Несмотря на это, мы не наблюдаем никакого систематического пакетного эффекта между нашими образцами. Однако мы видим различия в экспрессии генов от одного субъекта к другому среди некоторых конкретных типов клеток. Объединенные образцы позволяют нам выделить эти различия в задействованных типах клеток.

    Контроль качества (КК) и секвенирование библиотек

    Количественное определение библиотек проводилось с помощью флуорометра Qubit 3 (Invitrogen), а качество оценивалось с помощью биоанализатора (Agilent).Эквивалентные молярные концентрации библиотек объединяли и считывания корректировали после секвенирования пулов в Miseq (Illumina). Затем библиотеки секвенировали на приборе Novaseq 6000 (Illumina) в Нью-Йоркском центре генома (NYGC) в соответствии с рекомендациями 10X Genomics.

    Анализ данных стволовых клеток мыши snRNAseq

    Данные SnRNAseq для каждой мыши были обработаны и проанализированы, как описано ранее 13 . Необработанные чтения из каждого образца мыши были выделены из кластеров, назначенных в Seurat как «стволовые клетки», с использованием функции «WhichCells».Эти таблицы подсчета были интегрированы с использованием рабочего процесса Seurat (v3.1.5) SCTransform 48 , сгруппированы с разрешением 0,5 и размерами главных компонентов 1:15, которые были взяты для анализа.

    Метод повторной кластеризации стволовых клеток человека

    После первоначальной кластеризации полных наборов данных кластеры «стволовых клеток» были выделены у каждого отдельного субъекта с использованием функции Seurat «subset». Чтобы увеличить количество клеток, доступных для последующего анализа, изолированные наборы данных стволовых клеток были объединены на основе приблизительного возраста субъектов.Это было выполнено с помощью функции слияния в Seurat (v3.1.5). Интеграция выборки путем идентификации якорей и последующей кластеризации (20 PCA, разрешение 0,5) выполнялась с использованием Seurat в соответствии со стандартными процедурами 45, 46 . Повторная кластеризация и анализ, ведущие к идентификации «коммитирующих» стволовых клеток, были выполнены, как указано выше, после удаления кластеров клеток «Pars Tuberalis».

    мРНК RNAscope

    in situ гибридизация

    Постнатальный гипофиз мышей CD-1 дикого типа рассекали на P3, P15 (самцы) и P56 (самцы) и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (Sigma) при комнатной температуре в течение 16 -24 часа.Образцы были промыты в PBS и обезвожены в серии этанола перед заливкой в ​​парафин, как описано ранее 15 . Образцы были срезаны по 5 мкм.

    Анализ RNAscope 2.5 HD Duplex (Advanced Cell Diagnostics) использовался в соответствии с рекомендациями производителя со следующими специфическими зондами: Mm-Jun (Cat# 453561) и Mm-Sox2-C2 (Cat# 401041-C2) (Advanced Cell диагностика). Срезы были контрастно окрашены гематоксилином Майера (Vector H-3404) и помещены в среду Vectamount Permanent Mounting Medium (Vector H-5000).

    Анализ траектории псевдовремени sn

    Необработанные значения количества генов были извлечены из кластера «стволовых клеток» каждого образца, как ранее было определено с помощью Seurat (v4.0.1) 49 . Из-за половых различий мужские и женские образцы обрабатывались отдельно. Образцы одного и того же пола (например, девочки-дети, женщины-взрослые, женщины в возрасте) были интегрированы с использованием функций « SCTransform » и « SelectIntegrationFeatures » в Seurat для получения 500 лучших генов с дифференциальной экспрессией (DEG).Monocle3 (v0.2.3.0) 50 использовался для анализа траектории псевдовремени, и предварительный анализ выявил смещение траектории Monocle из-за определенных гормональных генов, а именно; Gh2 , PRL , CHGB , POMC , LHB , FSHB и CGA . Поэтому эти гены были исключены из 500 лучших DEG. Объекты-монокли были созданы путем объединения 3 образцов каждого пола с использованием соответствующих 500 лучших DEG. Траектория была рассчитана путем объединения разделов с корнем, выбранным на основе самой ранней точки времени, доступной для каждого пола.Чтобы найти генные модули, меняющиеся в течение псевдовремени, была проведена функция « graph test » с использованием параметра Neighbor_graph = «principal_graph» с разрешением 0,8 для функции « find_gene_modules ». Были выделены и дополнительно изучены 4 лучших обогащенных модуля для каждого возраста и пола, поскольку они показали наибольшую изменчивость между возрастными группами.

    Анализ данных PLIER

    Для более глубокого изучения тенденций в экспрессии генов заданных типов клеток по образцам и типам данных мы рассматривали каждый набор данных sc как набор объемных наборов данных для заданных помеченных типов клеток.Затем каждый тип клеток рассматривался как отдельное объемное измерение в каждом образце. Для данных snATACseq количество пиков для данного гена было получено путем выбора пика, наиболее близкого к месту начала транскрипции (TSS). Эти подсчеты пиков на ген затем были собраны в отдельные объемные измерения для каждого типа клеток в каждом образце. Мы сосредоточились конкретно на шести соответствующих типах клеток гипофиза: кортикотропных, гонадотропных, лактотропных, соматотропных, стволовых/прогениторных клетках и тиреотропных. Для набора данных snRNAseq этот процесс сгенерировал 36 массовых измерений в шести образцах (три самки и три самца), а для набора данных snATACseq мы сгенерировали 35 массовых измерений, поскольку тиреотропы не были идентифицированы в образце snATACseq взрослых мужчин.Мы применили PLIER 29 , который находит закономерности в данных подсчета, которые связаны с известной априорной информацией (например, Reactome и Kegg), сосредоточившись на 2000 генах с самым высоким стандартным отклонением в значениях подсчета в массовых измерениях в каждом наборе образцов. . PLIER запускался для каждого набора образцов отдельно, при этом LV генерировались на основе объемных измерений в неконтролируемом режиме. Затем были отобраны LV, чтобы найти закономерности, относящиеся к отдельным типам клеток, а также тенденции в масштабах выборки, такие как половые различия.Статистическая значимость LV была рассчитана с помощью непараметрического теста Крускала-Уоллиса для нескольких групп в рамках R-метода stat_compare_means. Сравнения между LV внутри и между типами данных были достигнуты путем сравнения перекрытия 200 генов, наиболее связанных с данным LV.

    B — это значение экспрессии, полученное с помощью PLIER, для генов, связанных с данным LV в разных образцах. Его можно рассматривать аналогично средней экспрессии, взвешенной по ассоциации генов с LV.Технически B представляет собой матрицу размера #LVs x #Samples. Это одна из двух матриц в PLIER, наряду с Z размером # генов x # LV. Цель PLIER — найти значения B и Z, минимизирующие уравнение ||Y — Z*B|| где Y — наша матрица данных размера #genes x #samples. Таким образом, PLIER находит подходящее количество LV, которые можно использовать для соединения генов и образцов и точной оценки нашей матрицы данных.

    Для статистического анализа блочной диаграммы ( Дополнительный рис. 12 ) ggboxplot генерирует блочную диаграмму с центром, равным 50-му процентилю, границами прямоугольника являются 25-й и 75-й процентили, а границы усов являются наименьшими / самые большие значения 1.5-кратный межквартильный диапазон ниже 25-го процентиля или выше 75-го процентиля, соответственно.

    Интеграция данных Sn

    Данные snRNAseq и snATACseq были интегрированы на основе эталонного запроса, в основном с использованием функций «FindTransferAnchors» и «TransferData» из пакета Seurat v3 45, 46 . Наборы данных snRNAseq использовались в качестве эталона, и к ним были интегрированы другие модальности. Чтобы интегрировать snATACseq в snRNAseq, матрица доступности пика за клеткой была преобразована в матрицу активности гена за клеткой на основе доступности хроматина в пределах тела гена каждого гена и области 2kb выше по течению, в предположении, что доступность хроматина и экспрессия гена положительно коррелировали.Вариабельные признаки из данных snRNAseq использовались для нахождения якорей, а данные snATACseq в низкоразмерном встраивании LSI использовались для переноса данных из snRNAseq в snATACseq.

    Анализ линейного моделирования

    Регуляторная модель экспрессии генов из набора данных sn multiome была построена для каждого целевого гена в несколько этапов: 1) Был выбран список потенциальных регуляторных областей генома. Они включали: а) любые пики ATAC, которые перекрывались с областью TSS +/-2kb, б) дистальные пики, которые находились не более чем в 500 kb от TSS и были доступны совместно с любым из пиков в a).Показатели совместной доступности рассчитывались с использованием пакета Cicero 51 с параметрами по умолчанию, и для выбора совместно доступных пиков использовалось пороговое значение 0,25 для оценок совместной доступности. 2) Список потенциальных регуляторных ТФ был выбран путем сканирования сайтов связывания ТФ в выбранных областях генома с использованием функции «matchMotifs» (с отсечением значений ар 5e-5) из пакета r «motifmatchr» и матриц весов позиций ( PWM) из базы данных JASPAR CORE. 3) Линейная регрессия использовалась для моделирования экспрессии гена-мишени в клетках в зависимости от экспрессии выбранных TF и ​​открытости пиков ATAC, а коэффициенты регрессии использовались для измерения важности каждого TF и ​​геномной области.В регрессии использовали нормализованное количество РНК SCTranform 48 и нормализованное количество пиков ATAC TFIDF.

    Статистика

    В Рис. 5a для расчета статистической значимости изменений экспрессии или доступности в пределах данной латентной переменной мы применили двухфакторный дисперсионный анализ для множественного группового тестирования и критерий Тьюки для попарных сравнений. Каждое испытание применялось к женским и мужским образцам отдельно. В обоих случаях мы применяли статистические функции R aov и TukeyHSD с аддитивной моделью Выражение ~ «Тип клетки» + «Возрастная группа » для расчетов.

    В дополнительных рис. . 11a и , 12a , иерархическая кластеризация показателей LV B была выполнена с помощью метода полного связывания по умолчанию, используемого функцией R тепловой карты .

    Для анализа коробчатых диаграмм в Дополнительный рисунок 12c анализ был проведен с n = 3 независимыми субъектами каждого пола и статистическим анализом с использованием критерия ранжированной суммы Уилкоксона.

    Для рис. 6 и дополнительных рис. 15-19 , P-значения пиков и P-значения TF были получены с помощью линейной регрессии (функция «lm» в R) на 9151 ячейке (для пангипофизарных результатов) и 1623 клетках (для пангипофизарных результатов). специфические результаты стволовых клеток).Кроме того, для статистического анализа TF TF представлены только в том случае, если их значения P с поправкой Бонферрони <0,05. Подробная статистика (например, значения t линейной регрессии) представлена ​​в дополнительной таблице 8 .

    Авторские вклады

    ZZ, MZ, GRS, VY и OGT предоставили аналитические инструменты и проанализировали данные; TLW предоставила аналитические инструменты, проанализировала данные и провела исследования; Исследования проводили НМ, ВДН, НС, МАА и МВ; HP подготовила рукопись; SCS разработал исследование, проанализировал, интерпретировал данные и составил рукопись, CLA, JLT и DJB проанализировали, интерпретировали данные и составили рукопись; FRZ разработал исследование, провел исследование, проанализировал и интерпретировал данные, составил рукопись.Все авторы отредактировали рукопись и утвердили ее окончательный вариант.

    Какова динамика разрешения тромба?

    Обсуждается больной 29 лет с функционирующей макроаденомой гипофиза. Масса гипофиза была обнаружена с помощью МРТ после того, как у пациента возникла внезапная головная боль, наводящая на мысль об апоплексическом ударе. Головная боль снимается обезболивающими препаратами. В течение периода последующего наблюдения в течение одной недели гипофизарная масса спонтанно регрессировала почти до половины своего первоначального размера без какой-либо терапии.Больной никогда не предъявлял никаких жалоб на зрение и не проявлял признаков гипопитуитаризма. Присутствовал повышенный уровень пролактина. Через семь недель после начального события опухоль гипофиза показала продолжающуюся регрессию на МРТ. Уровень пролактина оставался повышенным. Этот случай дает уникальный взгляд на быструю спонтанную регрессию масс-эффекта, которая может возникнуть после апоплексии аденомы гипофиза.

    1. Введение

    Апоплексия в пролактиному не является редкостью и чаще возникает при макропролактиномах.В тех случаях, когда происходит кровоизлияние, большинство пациентов составляют женщины со средним возрастом при постановке диагноза 31 год, от 25 до 37 лет. Мужчины имеют средний возраст при постановке диагноза 41 год, от 32 до 54 лет [1]. Апоплексия опухоли гипофиза является редким событием с общими признаками и симптомами. В зависимости от выраженности симптомов и признаков проводят консервативное или оперативное лечение. В редких случаях лечение может быть ненужным, так как опухоль гипофиза может спонтанно регрессировать. Хотя кровоизлияние может рассосаться и инволютировать само по себе, течение времени неизвестно.Здесь мы представляем случай быстро регрессирующей гипофизарной апоплексии и потенциальное время для рассасывания тромба.

    2. Описание случая

    29-летний мужчина обратился с жалобами на утомляемость и внезапные приступы головной боли в левой части головы. Усталость присутствовала в течение примерно шести месяцев. Головная боль появилась совсем недавно. Пациент сообщил, что головная боль ощущалась как мигрень и была достаточно сильной, чтобы он обратился в отделение неотложной помощи. Сделали МРА, результат отрицательный.КТ головы выявила сомнительное увеличение гипофиза. Затем была проведена МРТ без контраста, которая показала массу 2,5 см в максимальном диаметре (рис. 1), возникающую из турецкого седла с левой стороны, с некоторым супраселлярным расширением и хиазмальным возвышением зрительного нерва. В то время пациент получил Дилаудид, и его головная боль прошла. Проверка поля зрения еще не проводилась, но жалоб на зрение не было. У пациента также не было признаков акромегалии, гипотиреоза или несахарного диабета.Люмбальная пункция была выполнена в реанимационном отделении, которая была отрицательной.

    Неделю спустя, после обследования и лечения в отделении неотложной помощи, у пациентки был отмечен повышенный уровень пролактина 120 нг/мл (норма 4,0–15,2 нг/мл). Другая МРТ, проведенная с контрастом, выявила образование гипофиза с неоднородным усилением (рис. 2). Отмечено значительное уменьшение размеров макроаденомы гипофиза с регрессом от 2,5 до 1,5 см в максимальном диаметре. Супраселлярное расширение, которое присутствовало на предыдущей МРТ, также значительно регрессировало.Однако ножка гипофиза оставалась отклоненной вправо. Профиль гипофизарных гормонов пациента был нормальным, за исключением повышенного пролактина, вероятно, из-за стебель-эффекта или неэффективной макропролактиномы: ТТГ 4,7 мМЕ/л (норма 0,3–5,0 мМЕ/л), свободный тироксин 0,9 нг/дл (норма 0,8–1,8). нг/дл), общий тестостерон 512 нг/дл (норма 240–950 нг/дл), биодоступный тестостерон 113 нг/дл (норма 83–257 нг/дл), кортизол AM 12 мкг/дл (норма 7–25 мкг/дл). дл), пролактин 151 нг/мл (норма 4,0–15,2 нг/мл), ЛГ 2.8 МЕ/л (норма 1,8–8,6 МЕ/л), инсулиноподобный фактор роста 113 нг/мл (норма 75–275 нг/мл) и кортикотропин 21 пг/мл (норма 10–60 пг/мл). Уровень ФСГ не был получен.

    При спонтанной регрессии образования гипофиза и отсутствии нарушений зрения при клиническом осмотре транссфеноидальную резекцию этого образования не рекомендовали. Чтобы установить базовый уровень массы гипофиза и оценить любые изменения после начала лечения, была проведена еще одна МРТ. Эта МРТ, сделанная через семь недель после поступления в отделение неотложной помощи, снова показала дальнейшее уменьшение размера гипофизарной массы, которая теперь составляет 8.Максимальный диаметр 1 мм (рис. 3) по сравнению с 1,5 см на предыдущей МРТ. По-прежнему имело место неоднородное усиление массы, хотя и меньшее, чем в предыдущем исследовании. Ножка гипофиза также оставалась отклоненной вправо. Отмечена асимметрия перекреста зрительных нервов с нижним расположением левой стороны. Считалось, что это открытие является результатом спаек с регрессирующей массой гипофиза. В связи с продолжающейся регрессией массы гипофиза и повышенным уровнем пролактина было принято решение продолжить лечение каберголином.

    3. Обсуждение

    Начало спонтанной регрессии аденом гипофиза после апоплексии четко не определено, равно как и время, необходимое для полного разрешения. Этот конкретный случай показывает, что спонтанная регрессия может произойти уже через неделю после апоплексического удара. Он также показывает скорость уменьшения для этой конкретной макроаденомы гипофиза. Со скоростью, с которой она уменьшалась, масса потенциально могла рассосаться сама по себе без какого-либо дальнейшего лечения.Этот случай вносит свой вклад в литературу, которая представляет спонтанную регрессию аденом гипофиза.

    Здесь обсуждаются несколько случаев регрессии аденомы гипофиза без какого-либо лечения. Качара и др. представьте случай 42-летнего мужчины с внезапным началом головной боли в сочетании с рвотой в анамнезе. Пациента лечили только обезболивающими препаратами, и его симптомы исчезли в течение одной недели. Компьютерная томография показала усиливающее контраст селлярно-супраселлярное образование без расширения.МРТ, проведенная через шесть недель, показала полное разрешение аденомы гипофиза. Макроаденома гипофиза у пациентки полностью разрешилась без лечения и без признаков гипопитуитаризма [2]. Лю и др. представьте случай 66-летнего мужчины с двухмесячной историей головных болей, но у него внезапно возникла сильная головная боль с рвотой и правым птозом. МРТ выявило интраселлярное образование. Гормональный профиль гипофиза показал признаки гипопитуитаризма. Пациента лечили пероральным преднизоном и L-тироксином с исчезновением головной боли и улучшением зрения в течение двух дней.Через три месяца повторная МРТ показала полное разрешение селлярной массы [3]. Райнов и Беркерт представляют случай мужчины с макропролактиномой, которая спонтанно уменьшилась без какой-либо терапии через шесть месяцев. Нет никаких упоминаний о полном разрешении, как в двух других случаях, но, как и в двух других случаях, гипофизарное образование все же уменьшилось в размерах [4].

    В нашем конкретном случае, когда у пациента потенциально была неэффективная макропролактинома, было показано, что опухоль спонтанно уменьшается в течение одной недели без какого-либо лечения.Хотя до принятия решения о назначении каберголина полного разрешения не наступало, наш случай дает уникальную возможность проследить спонтанное уменьшение размера гипофизарного образования после апоплексического удара. Этот случай также позволяет нам наблюдать, как скоро может произойти редукция. За одну неделю масса гипофиза пациента уменьшилась с 2,5 см (рис. 1) до 1,5 см (рис. 2), что на 40 % меньше исходного размера. Через семь недель после первоначального события масса теперь составляла 8,1 мм (рис. 3), что соответствует 67.Уменьшение на 6% от исходного размера. Качара и др. показали, что новообразование может полностью рассосаться за 6 недель, в то время как Liu et al. показали, что это может произойти через 3 месяца. Райнов и Буркерт указывают на еще более длительный период времени, в течение которого происходит сжатие. В отличие от этих предыдущих случаев, наш случай обеспечивает визуализацию в двух временных точках после первоначального проявления симптомов апоплексического удара. Имея только одну временную точку, потенциальный временной ход для разрешения тромба не может быть установлен. Тем не менее, два последующих МРТ-исследования нашего пациента делают это возможным.

    Аденомы гипофиза могут протекать бессимптомно, а апоплексия опухоли гипофиза может быть первым признаком наличия аденомы. Считается, что апоплексия опухоли гипофиза связана с быстрорастущей опухолью, которая превышает ее сосудистое снабжение, в то время как другая гипотеза предполагает сдавление портальных сосудов растущей массой, что приводит к ишемическому некрозу с кровоизлиянием или без него [5]. Апоплексия характеризуется резкой головной болью, тошнотой, рвотой, снижением остроты зрения, дефицитом полей зрения, парезом глаз, офтальмоплегией и нарушением сознания [5–7].Из этих симптомов головная боль является наиболее распространенной. В данном конкретном случае головная боль была единственным симптомом, испытываемым пациентом. Несмотря на супраселлярное распространение гипофизарной массы, касающейся перекреста зрительных нервов, у пациента не было клинически очевидных проблем со зрением или дефицита. Если у пациента были какие-либо зрительные аномалии или измененный психический статус в связи с образованием гипофиза, будет показана хирургическая резекция образования через транссфеноидальный доступ. Было показано, что этот подход улучшает результаты и значительно улучшает дефицит зрения [5-7].

    Хирургическое вмешательство показано в большинстве случаев гипофизарной апоплексии, но в некоторых случаях можно использовать консервативное лечение. Коррекция электролитного дисбаланса, гемодинамическая стабилизация и восполнение запасов кортикостероидов являются одними из наиболее важных начальных вмешательств [5]. Ни один из них не был указан в нашем конкретном случае. Пациентов со стабильными, улучшающимися или отсутствующими визуальными симптомами можно лечить консервативно. Было показано, что при наличии биохимических признаков пролактиномы во время обследования медикаментозное лечение с использованием агонистов дофамина дает отличные результаты [5].Это открытие является причиной того, что в нашем случае было принято решение назначить пациенту лечение каберголином; однако это было начато на 7-й неделе. Повышение пролактина у этого пациента было умеренным, что позволяет предположить, что его гиперпролактинемия может быть связана со стеблевым эффектом или неэффективной макропролактиномой. Макропролактиномы имеют размеры более 1,0 см и проявляются симптомами гипогонадизма примерно у 80% пациентов мужского пола. Они обычно связаны с уровнем пролактина в сыворотке > 250 нг/мл, а уровень > 500 нг/мл делает диагноз почти достоверным [8].

    Стеблевой эффект обычно проявляется при уровне пролактина 30–200 нг/мл, и это повышение связано со снижением дофаминергического ингибирования [9]. При обнаружении отклонения ножки гипофиза и умеренного повышения пролактина эффект ножки определенно является потенциальной причиной. Однако размер аденомы гипофиза пациента наряду с повышением уровня пролактина также может свидетельствовать о макропролактиноме. Симптомы гипогонадизма присутствуют не у всех пациентов с макропролактиномой, а умеренно повышенный уровень пролактина может отражать неэффективную макропролактиному.Для окончательного установления аденомы гипофиза как макропролактиномы требуется иммуногистохимия [10]. Хотя мы не можем определить точную причину гиперпролактинемии у нашего пациента, нет сомнений в том, что размер его аденомы гипофиза уменьшился.

    О регрессии и исчезновении аденом гипофиза после апоплексии обычно сообщают после медикаментозного или хирургического лечения пациентов. Однако скорость разрешения неизвестна. Было показано, что апоплексия снижает выработку гипофизарных гормонов, выделяемых функционирующими аденомами гипофиза, что приводит к спонтанному исчезновению симптомов и в некоторых случаях к гипопитуитаризму [11, 12].

    Сообщалось о снижении гормональных эффектов, связанных с акромегалией и болезнью Кушинга [13, 14]. Мы не оценили подобные выводы. В нашем случае речь идет о функциональной макроаденоме гипофиза без симптомов, связанных с повышенным уровнем гормонов, которая начала регрессировать без какого-либо лечения. Учитывая клинические данные нашего пациента и эндокринный профиль, было начато соответствующее лечение карберголином. Если бы пациент обратился к нам в момент времени более чем через семь недель после его первоначального обращения, сгусток в его гипофизе, возможно, уже полностью рассосался.Мы не можем сказать наверняка, но, как показали предыдущие случаи, возможно полное излечение после апоплексического удара без существенного лечения. В этом конкретном случае, представляющем собой спонтанную регрессию макроаденомы гипофиза, связанную с гиперпролактинемией, последующее наблюдение за этим пациентом будет иметь решающее значение, чтобы увидеть, как каберголин способствует дальнейшей регрессии этой опухоли.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.