Кониум 6 гомеопатия показания к применению: показания и противопоказания, состав и дозировка – АптекаМос

Содержание

КОНИУМ МАКУЛАТУМ C30 ГОМЕОПАТ МОНОКОМП ПРЕПАРАТ РАСТИТ ПРОИСХОЖД 5,0 ГРАНУЛЫ ГОМЕОПАТИЧ

Гомеопатический монокомпонентный препарат, действие которого обусловлено компонентами, входящими в его состав.

Conium maculatum /Conium — болиголов пятнистый, относится к семейству зонтичные.

Препарат готовят из настойки свежего растения с цветами.

Химический состав: алкалоиды-кониин, конгидрин, псевдоконгидрин, g-коницеин, метилкониин, кверцетин и кемферол.

Показания

Применяется при различных симптомах.

Ключевые симптомы для назначения препарата в комплексном лечении:

• головокружения у старых ослабленных лиц, усиливающиеся при смене положения тела, особенно при повороте головы в сторону и при закрытых глазах;

• последующее лечение острых инсультов;

• плотный зоб с гипо — или гиперфункцией щитовидной железы, особенно у пожилых ослабленных ворчливых людей;

• застойная предстательная железа;

• последствия ушиба или сдавления молочной железы.

Основные случаи клинического применения:

Нервная система

• головные боли;

• сжатие в висках;

• головокружение;

• ощущения онемения/ползания мурашек;

• раздражительность;

• нежелание разговаривать;

• страхи.

Глаза

• сильное слезотечение;

• фотофобия;

• дальнозоркость стариков;

• колющие и жгучие боли в глазах.

Органы дыхания

• кашель спастический;

• кашель с мокротой.

Органы пищеварения

• тошнота;

• кислые отрыжки;

• изжога;

• метеоризм.

Мочеполовые органы

• недержание мочи;

• задержка мочеиспускание;

• прерывистая струя;

• индурация яичек;

• импотенция.

Кожа

• сыпь;

• мокнущие и сухие экземы;

• пятна коричневые или красные на разных частях тела.

Перед применением рекомендуется проконсультироваться с врачом.

Источники информации:

1. www.vidal.ru

2. Берике В. Materia Medica гомеопатических препаратов. М.: Гомеопатическая медицина,2000.236с.

3. Моррисон Р. Настольный справочник ключевых и подтверждающих симптомов. М.: Гомеопатическая медицина,2016.

4. Вавилова Н.М. «Гомеопатическая фармакодинамика», — М: Гом.центр «Эверест», — 1994 Том 2, 180с.

Кониум-плюс — гранулы гомеопатические, инструкция, способ применения и дозы, побочные действия, отзывы о препарате — Энциклопедия лекарств РЛС

Дата обновления страницы 16. 11.2020

все производителиДоктор Н ООО [Москва, ул.Шипиловская]

Содержание

Фармакологическая группа

Лекарственная форма

Гранулы гомеопатические.

Состав

Состав (на 100 г):

Активные компоненты:

Hydrastis Canadensis ( Hydrastis ) (гидрастис канаденсис (гидрастис)) С6- 0,17 г, Kalium iodatum ( Kalium jodatum ) (калиум иодатум (калиум йодатум)) СЗ-0,17 г, Thuja occidentalis ( Thuja ) (туя окциденталис (туя)) СЗ-0,17 г, Conium maculatum ( Conium ) (кониум макулатум (кониум)) СЗ-0,17 г, Phytolacca Americana ( Phytolacca ) (фитолакка американа (фитолакка)) СЗ-0,17 г, Marsdenia cundurango ( Condurango ) (марсдения кундуранго (кондуранго)) СЗ-0,17 г;

Вспомогательные компоненты:

Гранулы сахарные — 100 г.

Фармакологическое действие

Многокомпонентный гомеопатический препарат, действие которого обусловлено компонентами, входящими в его состав.

Описание лекарственной формы

Однородные гранулы правильной шаровидной формы, белого или белого с серым или кремовым оттенком цвета, без запаха.

Фармако-терапевтическая группа

Гомеопатическое средство.

Показания

Фиброзно-кистозная мастопатия доброкачественной этиологии, мастодиния, предменструальный синдром.

Противопоказания

Повышенная чувствительность к компонентам препарата.

Возраст до 18 лет.

Применение при беременности и кормлении грудью

Прием препарата возможен, если ожидаемая польза для матери превышает потенциальный риск для плода и ребенка. Необходима консультация врача.

Способ применения и дозы


По 8 гранул под язык до полного рассасывания 5 раз в день.

Продолжительность лечебного курса — до 8 недель. Возможно проведение повторных курсов лечения.

Передозировка

Случаи передозировки до настоящего времени не были зарегистрированы.

Побочные действия

Возможны аллергические реакции.

Особые указания

При отсутствии терапевтического эффекта, а также появлении побочных эффектов, не описанных в инструкции препарата, следует обратиться к врачу.

Информация для больных сахарным диабетом — приём рекомендованной суточной дозы препарата в гранулах сахарных соответствует 0,13 хлебной единицы.

Влияние на способность управлять транспортными средствами и работать с механизмами

Не влияет.

Взаимодействие

Возможно одновременное применение других лекарственных средств.

Форма выпуска

Гранулы гомеопатические.

По 20,0, 40,0 г во флаконы оранжевого стекла с винтовой горловиной, укупоренные пластмассовыми крышками из полиэтилена. По 5,0 г в пеналы из полиэтилена или полипропилена. По 10,0, 15,0 или 20,0 г в банки из полиэтилена или полипропилена с крышками из полиэтилена или полипропилена.

Каждый флакон, пенал или банку вместе с инструкцией по применению помещают в пачку из картона коробочного.

Условия отпуска из аптек

Срок годности

5 лет.

Не применять по истечении срока годности.

Условия хранения

В сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 25 °С.

Хранить в недоступном для детей месте.

Заказ в аптеках

Алтайский крайАмурская областьАрхангельская областьАстраханская областьБайконурБелгородская областьБрянская областьВладимирская областьВолгоградская областьВологодская областьВоронежская областьЕврейская автономная областьЗабайкальский крайИвановская областьИркутская областьКабардино-Балкарская РеспубликаКалининградская областьКалужская областьКамчатский крайКарачаево-Черкесская РеспубликаКемеровская областьКировская областьКостромская областьКраснодарский крайКрасноярский крайКурганская областьКурская областьЛенинградская областьЛипецкая областьМагаданская областьМоскваМосковская областьМурманская областьНенецкий автономный округНижегородская областьНовгородская областьНовосибирская областьОмская областьОренбургская областьОрловская областьПензенская областьПермский крайПриморский крайПсковская областьРеспублика АдыгеяРеспублика АлтайРеспублика БашкортостанРеспублика БурятияРеспублика ДагестанРеспублика ИнгушетияРеспублика КалмыкияРеспублика КарелияРеспублика КомиРеспублика КрымРеспублика Марий ЭлРеспублика МордовияРеспублика Саха (Якутия)Республика Северная Осетия — АланияРеспублика ТатарстанРеспублика ТываРеспублика ХакасияРостовская областьРязанская областьСамарская областьСанкт-ПетербургСаратовская областьСахалинская областьСвердловская областьСевастопольСмоленская областьСтавропольский крайТамбовская областьТверская областьТомская областьТульская областьТюменская областьУдмуртская РеспубликаУльяновская областьХабаровский крайХанты-Мансийский автономный округЧелябинская областьЧеченская РеспубликаЧувашская РеспубликаЧукотский автономный округЯмало-Ненецкий автономный округЯрославская область

Представленная информация о ценах на препараты не является предложением о продаже или покупке товара.
Информация предназначена исключительно для сравнения цен в стационарных аптеках, осуществляющих деятельность в соответствие со статьей 55 Федерального закона «Об обращении лекарственных средств» от 12.04.2010 N 61-ФЗ.

Отзывы

Оставьте свой комментарий

Тиреосан капли 25 мл

Способ применения

Курсовое лечение под наблюдением врача-эндокринолога. При гиперфункциональных нарушениях – по 1-2 капли 2 раза в день в сочетании с препаратами йода по показаниям. При гипофункциональных нарушениях по 5-7 капель 2-3 раза в день с перерывом на каждый 7-й день приёма. Совместим с другими препаратами (гормонорегулирующей терапией). При узловых нарушениях – длительный курс (3-6 месяцев с перерывами на неделю после каждого месяца приёма) под инструментальным контролем (УЗИ-сканирование). Перед применением препарат необходимо встряхивать. Капли необходимо перед проглатыванием подержать ворту до 1 минуты. Препарат принимать за 20-30 минут до еды. К препарату дополнением могут послужить настойки ГОМЕОФИТОТЕРАПИИ: при гиперфункции — Буквица, Донник, Зопник, Зюзник, Лобазник, Норичник, Орех грецкий. при гипофункции: Бузина чёрная, Герань, Дрок красильный, Дурнишник, Коронария, Норичник, Люцерна или гомеопатические монопрепараты: Scrofullaria nodosa C3, Lycopus europeum D3.

Описание

ТИРЕОСАН — капли гомеопатические.

Терапевтическое действие: тиреотропное, противовоспалительное, иммуномодулирующее, пластическое.

Показания к применению компонентов комплекса:

1. BODIAGA SPONGIA Бодяга С3 – (Пресноводная губка в разведении 10 — 6).

— Действие на мышцы, лимфатическую систему, кожу, слизистые.

— Струма коллоидная и паренхиматозная; увеличение и узловое перерождение различных желёз, в т.ч. щитовидной.

— Общая слабость и крайне болезненная чувствительность кожи.

2. CONIUM MACULATUM — Кониум С3 (Болиголов пятнистый в разведении 10 — 6).

— Регулирует функцию железистой ткани, способствует рассасыванию кист, узлов, затвердений в железах (грудные, яичники), а также узлов в матке.

— Действие на нервную систему, лимфатическую систему.

— Преждевременное старение по эндокринному типу, мышечная слабость.

3. LAPIS ALBUM — Ляпис альбум С6 (Кремниево-фтористый кальций в разведении 10 -12).

— Скрофулёз, уплотнение шейных желёз.

— Узловой зоб.

— Фиброаденомы грудных желёз, миома матки, хронические гнойные процессы.

4. FUCUS VESICULOSUS — Фукус С3 (Водоросль Фукус в разведении 10 — 6).

— Регулирует функцию щитовидной железы, нормализует обмен веществ, особенно

— при его снижении и накоплении избыточных запасов.

— Снижает аппетит.

— Действие на обменные процессы, эндокринную систему, лимфатическую систему.

— Ожирение, сахарный диабет, паренхиматозный зоб.

Номенклатура гомеопатических препаратов | Family Care

Показания Детализация симптомов Название комплекса Состав
1. При болезнях печени, воспалении желчного пузыря и протоков,  камнях желчного пузыря. ХолехолHL

 

 

Хелидониум

Ликоподиум

Берберис

Кардуус маринус

Тараксакум

2. При болезнях горла и носоглотки Боли в горле при глотании, затрудненное дыхание через нос вследствие увеличения аденоидной ткани. АденохолHL Барий карбоникум

Теукрум

Туя

Гепар сульфур

3. Для очистки организма и снятия интоксикации Уменьшает потребность в приеме алкоголя, снимает токсичекую нагрузку на печень.
СанихолHL-1
Ацидум сульфурикум

Аурум металликум

Кардуус марианус

Селениум

4. Восстанавливает желчеотток и качество желчи, нормализует работу печени после приема алкоголя, медикаментозной и пищевой нагрузки
СанихолHL-2
Нукс вомика

Колоцинт

Бриония

Ликоподий

5. При нарушении обмена веществ

Улучшает, работу печени и почек

СанихолHL-3 Кальций карбоникум

Ликоподиум

Солидаго

Берберис

6. При проблемах щитовидной железы Профилактика нарушений работы железы при аутоиммунном тиреоидите, после тяжелых заболеваний, интоксикации, стрессовых нагрузок (при склонности к снижению функции железы). ТиреохолHL -1 Спонгия

Фукус

Кальций йод

Кониум

Силицея

Туя

7. При узловом зобе ТиреохолHL – 2 Кальций йод

Меркуриус бийодатус

Сульфур йод

Селен

8. При тиреотоксикозе (повышенной функции щитовидной железы) ТиреохолHL – 3 Спонгия 6

Йодум 6

Кактус 6

Купрум арсеникозум 6

 

9. При нарушениях минерального обмена и проблемах  костной ткани Регулирует обмен кальция, способствует правильному формированию костей и зубов в период роста. Средство профилактики рахита, кариеса, сколиоза. КальцехолHL

 

 

Кальциум карбоникум 6

Кальциум фосфорикум 6

Кальциум флюорикум 6

Силицея 6

10.
11. Лечение и профилактика остеопороза, заживление переломов костей ОстеохолHL Кальциум фосфор

Симфитум

Арника

Рута

12. При гриппе, простуда и ОРВИ Препарат для лечения гриппа и его профилактики, а так же острых респираторных инфекций, отита, ринита, бронхита. При интоксикации с высокой температурой. ГриппхолHL

(осцилококцинум)

 Отфильтрованный автолизат печени

сердца берберийской утки

13. Грипп, простуда, при истинном вирусном гриппе как профилактическое и лечебное средство, при повышении температуры, насморке, лихорадке.

В начале заболевания: головная боль, озноб при подъёме температуры (Антигрипп 1).

Головная боль, чувство жара, высокая температура (Антигрипп 2)

АнтигриппHL-1

 

Арсен йод

Бриония

Гельземиум

Эупаториум

14. АнтигриппHL-2

 

Белладонна

Апис

Арника

Баптисия

15. При подъеме температуры.  АнтижарHL

 

Аконит

Бриония

Рус

Феррум фосфорик

16. При климаксе Приливы жара, обильные поты, сердцебиения, скачки давления, бессонница, тревожность, раздражительность КлимактохолHL-1

 

Туя

Ацидум нитрикум

Арсен альбум

17. Приливы жара, головокружение. Эмоциональная нестабильность. Нарушения менструального цикла.. КлимактохолHL-2

 

Лахезис

Сульфур

Сангвинария

18. Папилломы, бородавки Плоские юношеские, обыкновенные плотные ороговевающие, себорейные ПапилломахолHL

 

Туя

Ацидум нитрикум

Арсен альбум

19. При нарушениях моче-солевого обмена и суставных проблемах Пяточная шпора.  

ШпораHL

Кальций флюорикум

Гекла лава

Берберис

Колхикум

20. Лечение и профилактика мочекаменной болезни, подагры. ПодагринHL-1 Берберис

Ац. Оксаликум

Ац. Фосфорикум

Колоцинт

21. Для лечения цистита, уретрита и цисталгии при моче-солевом диатезе. Солевой дренажHL

 

Петрозелинум

Кантарис

Эквизетум

Ува урзи

Подагрические и обменные поражения суставов с частими  обострениями. ПодагринHL-2

 

Ацидум бензоикум

Колхикум

Литий карбоникум

22. Отек и воспаление суставов АртрохолHL-1

 

Бриония

Нукс вомика

Уртика уренс

Формика руфа

23. Боли в суставах, нарушение их подвижности. АртрохолHL-2 Гиперикум

Рус

Арника

Бриония

24. Для похудения Ускоряет обменные процессы в жировой ткани  

СлимхолHL-1

 

Стафизагрия

Фукус

Нукс вомика

Графит

25. Применяется для снижения аппетита. СлимхолHL-2 Натрий муриатикум

Цимицифуга

Кониум

26. При наследственном нарушении обменных процессов со склонностью к полноте и ожирению. СлимхолHL-3

 

Графит

Фукус

Игнация

27.
28. При  вегетососудистой дистонии. Головокружения, слабость, нестабильность давления и сердцебиения. Вегетохол Гельземиум

Вератрум альбум

Ацидум фосфорикум

29. При заболеваниях простаты Аденома предстательной железы 1- 2 ст. АденомахолHL

 

Кониум

Сабаль

Кальциум флюор

30. Воспаления предстательной железы. ПростатахолHL

 

Апис

Туя

Пульсатилла

Дигиталис

31. При аллергии Вазомоторный ринит,  слезотечение, чихание – вызванные аллергенами разной этиологии. АллергохолHL-2 (сенной насморк) Эуфразия

Лобелия

Сабадилла

32. Аллергические заболевания с проявлениями на коже:: зудящие сыпи, волдыри. АллергохолHL-3 (крапивница) Апис

Уртика

Кальций карбоникум

33. Снижение аллергической готовности организма, при  жидких выделениях из носа, кашле. АллергохолHL-1 (сенной насморк) Аралия

Апис

Арсен йод

34. Нарушения менструального цикла Уменьшает проявления предменструального синдрома: боли голвные и боли в животе (спазмы, колки). МенохолHL-1

 

Магнезиум фосфорикум

Белладонна

Вибурнум опулюс

При нерегулярном менструальном цикле. МенохолHL-2

 

Апис

Пульсатилла

Сабина

35. При болезнях горла и гнойных инфекциях Острые тонзиллиты, рецидивирующие ангины. ТонзиллохолHL

 

Белладонна

Гепар сульфур

36. Фурункулезы, карбункулы и другие нагноения ( в часности,   в тканях миндалин). МеркуриохолHL

 

Меркурий солюбилис

Ляхезис

Эхинацея

Каустикум

Беладонна

37. При заболеваниях сосудов (эндертериит, атеросклероз, ангиопатии) Холодные кисти, стопы, боли при ходьбе в голенях, ощущение ползанья  мурашек АнгиохолHL

 

Секале корнутум

Купрум металликум

Табакум

38. При герпесе Пузырьковые сыпи со жгучими болями и прострелами, следовая невралгия

 

 

ГерпесHL

 

Натриум муриатикум

Капсикум

Рус

39. При запоре, атонии кишечника При атоническом запоре, но полезен и при других видах запоров. БриахолHL Алюмина

Бриония

Нукс вомика

Опиум

40. При ларингите, трахеите и бронхите Кашель разных видов.

 

 

ЛарингохолHL Бриония

Спонгия

Ипекакуана

41. При проблемах зрения Для пользователей компьютеров: перенапряжение глаз, боль в глазах. ВизихолHL-1

 

Агарикус

Магнезиум фосфор

Фосфор

42. Зрительное переутомление. Лечение и профилактика   неосложненной близорукости. ВизихолHL-2 Калабар

Рута

Арника

Кальций флюорикум

43. Для улучшения памяти Препарат активизирует умственную деятельность, улучшает память. ВундевитHL

 

 

Анакардиум

Барий карбоникум

Калий фосфорикум

44. При насморке Гнойный насморк с вязкими выделениями, гайморит, затяжной насморк с заложенностью носа, обилием слизи с сукровицей РинохолHL

 

Туя

Гидрастис

Калий бихромикум

45. При болезнях желудка Острые и хронические гастриты и дуодениты с болями жгучими, пекущими, голодными. Изжоги.

 

ГастрохолHL

 

Анакардиум

Арсеникум альбум

Аргентум нитрикум

46. При шейном остеохандрозе Боли и напряжение шее с головокружениями. ХондрохолHL

 

Гельземиум

Рус

Цимицифуга

47. При глистах Глистная инвазия: острицы, аскариды. ГельмихолHL-1

 

Цина

Спигелия

Артемизия абротанум

Теукримум

48. Применяется как у детей, так и у взрослых. С хорошим эффектом  применяется у домашних животных. Изгоняет паразитов, повышает местный иммунитет. ГельмихолHL-2 Арсен альбум

Цина

Филикс мас

Игланс

49. При гинекологических нарушениях Воспалительные заболевания яичников, придатков матки,  поликистоз яичников. ГинекохолHL-1

 

Гепар сульфур

Вибурнум опулюс

Лилиум тигринум

50. Лечение климактерических расстройств: нарушений менструального цикла, мастопатии.  

ГинекохолHL-2

 

Агнус кастус

Сепия

Цимицифуга

51. При гипертонии, головных болях Повышение артериального давления. Венозный застой в сосудах головы и шеи.

 

ГипертонHL

 

 

Аконит

Вератрум альбум

Глоноин

52. При проблемах с лактацией Недостаточная выработка молока, профилактика маститов.

 

 

ЛактоHL Агнус кастус

Уртика

Фитолакка

Пульсатила

53. При гиперактивности, рассеянном внимании у детей Нервозность, раздражительность, вспыльчивость, гиперактивность у детей. ДетовитHL Цина

Хамомилла

Стафизагрия

54. Для укрепления иммунитета Для активизации неспецифических защитных механизмов у часто болеющих с воспалительными или аллергическими реакциями. Тканевой дренаж.

 

ИммунолHL

 

Галиум

Бетуля

Эхинацея

55. При проблемах с сердцем Боли в области сердца , нарушение ритма сердца, перепады давления. КардиохолHL

 

Арника

Кактус

Кратегус

Глоноинум

56. При катаракте Старческая, диабетическая и другие виды катаракты. КатарактаHL

 

Кортизон

Сенега

Нафталин

57. При болезнях поджелудочной железы и расстройствах пищеварения Панкреатит, гастродуоденит;

расстройство пищеварения с коликами, вздутием живота, болями и поносом.

ПанкреохолHL-1

 

Колоцинт

Ирис

Меркурий дульцис

58. ПанкреохолHL-2

 

 Jodum

Podophyllum

Mercurius solubilis

Carbo vegetabilis

Lycopodium clavatum

Lachesis

Argentum nitricum

Veratrum album

59. При укусах насекомых Укусы ос, пчел, комаров, мошек и других насекомых. ИнсектохолHL Ледум

Апис

60. При маститах Доброкачественные уплотнения в молочных железах. МастовитHL

 

 

Фитолакка

Туя

Кониум

Кальций флюорикум

61. При бессонице АнтистрессHL

 

Самбукус

Цикута вероза

Аза фетида

Игнация

Стафизагрия

Авена сатива

Гиосциамус

Валериана

62. Для лечения неврозов, психоэмоциональных перегрузок. НервокомплексHL

 

Ацидум фосфорикум

Игнация

Псоринум

Калий броматум

63. Психосоматические нарушения, расстройства сна. НормасонHL

 

Авена сатива

Хамомилла

Калиум броматум

Валериана

64. При мигрени Головные боли сосудистого генеза МигренолHL

 

 

Гельземиум

Сангвинария

Спигелия

Мелилотус

65. При трещинах слизистых и кожи Трещины всех видов на коже, трещины анального отверстия,   трещины на губах, геморрой. ФрактохолHL

 

 

Пеония

Графит

Ацидум нитрикум

66. При папилломах, бородавках Папилломы, бородавки плоские юношеские, обыкновенные    плотные, ороговевающие, себорейные. ПапилловитHL Туя

Ацидум нитрикум

Арсен альбум

67. При воспалении десен Лечение и профилактика кариеса, воспаление и кровоточивость десен ( гингивит)  

СтоматохолHL

Плантаго

Стафизагрия

Креозот

Меркурий солюбилис

68. При бесплодии  Бесплодие при нарушении обмена веществ КиндерплюсHL-1 Рута

Йодум

Аристолохия

Графит

69. Дисфункция яичников. Снижение жизненных сил. Оказывает   тонизирующее действие. КиндерплюсHL-2 Сепия

Игнация

Цимицифуга

Натрий муриатикум

70. При атеросклерозе сосудов Лечение и профилактика мозговых расстройств при атеросклерозе.    Способствует нормализации уровня холестерина в крови, улучшению памяти,   уменьшению головокружения,шума в ушах. СклеровитHL Аурум йод

Барий карбоникум

Плюмбум металликум

Гинкго билоба

71. При кожных сыпях

 

Предпочтительно при упорных кожных болезнях, юношеские угри, себоррейный дерматит. СкинхолHL-1 Сульфур йод
Угревая сыпь на лице, туловище, юношеские угри.
СкинхолHL-2
Календула

Сульфур

Карбо вегетаб

72. Снижение никотиновой зависимости Уменьшает тягу к курению, снижает никотиновую зависимость, сглаживает синдром отмены. ТабакумHL Табакум

Нукс вомика

Плантаго

73. При травмах мягких тканей Применять при любых травмах мягких тканей. ТравмахолHL

 

Арника

Гиперикум

Календула

74. При кашле Для лечения кашля у детей при заболеваниях верхних  дыхательных путей, сухой, раздражающий и ночной кашель. КофахолHL Румекс

Антимониум тартарикум

Дрозера

Бриония

75. При цистите Лечение и профилактика мочекаменной болезни. УрохолHL Берберис

Ац. Оксаликум

Ац. Фосфорикум

Колоцинт

76. Для лечения цистита, уретрита и цисталгии ЦистохолHL Петрозелинум

Кантарис

Эквизетум

Ува урзи

77. При анемии Улучшает состав крови за счет лучшей ассимиляции железа    в организме, а так же стимулирует работу органов кроветворения. Показан    при носовых кровотечениях.  

ФеррохолHL

Феррум фосфорикум

Арсен альбум

Хина

Миллефолиум

78. При прорезывании зубов у детей Болевой синдром при прорезывании зубов у детей. Хамомилла плюсHL

 

Гиперикум

Хамомилла

Арника

Меркурий солюбилис

79. При кишечных расстройствах Растройство кишечника с послаблением стула, болями в животе и профилактика кишечных  заболеваний. ЭнтерохолHL Хина

Арсен альбум

Подофиллюм

Алоэ

80. При энурезе Ночные энурезы, недержание мочи при напряжении, чихании и кашле у детей и пожилых людей. Повышает  тонус сфинктеров мочевого пузыря. ЭнурохолHL

 

Белладонна

Пульсатилла

Эквизетум

Каустикум

81. Для повышения потенции Стимуляция функции половых органов, в том числе при импотенции репродуктивного возраста, переутомлении, истощении и преждевременном старении, нервном   перевозбуждении, депрессии, бессоннице, воспалении мочеполовых органов, снижении содержания кальция в костях.

 

ЭректохолHL

 

 

 

Агнус кастус

Селениум

Ликоподий

Гинзенг

Кониум-плюс – инструкция по применению, показания, дозы, аналоги

Цены в интернет-аптеках:

Кониум-плюс – многокомпонентное гомеопатическое средство, применяемое в гинекологии.

Форма выпуска и состав

Лекарственная форма – гранулы гомеопатические шаровидной правильной формы с однородной структурой белого с кремовым или серым оттенком или белого цвета, не имеют запаха (по 5 г в полипропиленовых или полиэтиленовых пеналах, в картонной пачке 1 пенал; по 40 или 20 г в стеклянных флаконах оранжевого цвета, в картонной пачке 1 флакон; по 20, 15 или 10 г в полиэтиленовых или полипропиленовых банках, в картонной пачке 1 банка).

Содержание действующих компонентов в 100 г Кониума-плюс:

  • Hydrastis (Hydrastis Canadensis) (гидрастис (гидрастис канаденсис)) C6 – 0,17 г;
  • Thuja (Thuja occidentalis) (туя (туя окциденталис)) C3 – 0,17 г;
  • Phytolacca Americana (Phytolacca) (фитолакка американа (фитолакка)) C3 – 0,17 г;
  • Conium (Conium maculatum) (кониум (кониум макулатум)) C3 – 0,17 г;
  • Kalium jodatum (Kalium iodatum) (калиум йодатум (калиум иодатум)) C3 – 0,17 г;
  • Condurango (Marsdenia cundurango) (кондуранго (марсдения кундуранго)) C3 – 0,17 г.

Вспомогательные вещества: гранулы сахарные.

Показания к применению

  • Мастодиния;
  • Предменструальный синдром;
  • Фиброзно-кистозная мастопатия.

Противопоказания

  • Возраст до 18 лет;
  • Гиперчувствительность к компонентам препарата.

Применение в период беременности и грудного вскармливания возможно только по рекомендации врача, если предполагаемая польза терапии для матери превосходит потенциальную угрозу для плода и ребенка.

Способ применения и дозировка

Гранулы принимают сублингвально, разместив под языком до полного растворения.

Рекомендованное дозирование: по 8 шт. 5 раз в сутки. Длительность одного курса – не более 8 недель.

Для достижения желаемого терапевтического эффекта курсы лечения можно повторять.

Побочные действия

На фоне приема Кониума-плюс возможно развитие аллергических реакций.

Особые указания

При отсутствии эффекта терапии или появлении нежелательных эффектов необходимо обратиться к врачу.

В рекомендованной суточной дозе препарата содержание сахара эквивалентно 0,13 ХЕ (хлебные единицы).

Препарат не оказывает влияние на способность пациента к управлению транспортными средствами и механизмами.

Лекарственное взаимодействие

Разрешено проведение сопутствующей терапии другими лекарственными препаратами.

Аналоги

Информация об аналогах Кониум-плюс отсутствует.

Сроки и условия хранения

Хранить в недоступном для детей, темном, сухом месте при температуре до 25 °C.

Срок годности – 5 лет.

Условия отпуска из аптек

Отпускается без рецепта.

Кониум-плюс: цены в интернет-аптеках

Название препарата

Кониум-плюс гранулы гомеопатические фл. 20г

ЦВ Протек

Об авторе

Ильин Валентин Валентинович Провизор Об авторе Образование:

Диплом по специальности «Фармация», Образовательная организация дополнительного профессионального образования «Международная академия экспертизы и оценки»

Диплом по специальности «Фармацевтическая технология», ООО «Национальный центр медицинского образования» совместно с Федеральным государственным бюджетным учреждением дополнительного профессионального образования «Всероссийским учебно-научно-медицинским центром по непрерывному фармацевтическому и медицинскому образованию»

Подробнее об авторе

Информация о препарате является обобщенной, предоставляется в ознакомительных целях и не заменяет официальную инструкцию. Самолечение опасно для здоровья!

Знаете ли вы, что:

Кровь человека «бегает» по сосудам под огромным давлением и при нарушении их целостности способна выстрелить на расстояние до 10 метров.

При регулярном посещении солярия шанс заболеть раком кожи увеличивается на 60%.

Раньше считалось, что зевота обогащает организм кислородом. Однако это мнение было опровергнуто. Ученые доказали, что зевая, человек охлаждает мозг и улучшает его работоспособность.

Многие наркотики изначально продвигались на рынке, как лекарства. Героин, например, изначально был выведен на рынок как лекарство от детского кашля. А кокаин рекомендовался врачами в качестве анестезии и как средство повышающее выносливость.

Человек, принимающий антидепрессанты, в большинстве случаев снова будет страдать депрессией. Если же человек справился с подавленностью своими силами, он имеет все шансы навсегда забыть про это состояние.

Во время работы наш мозг затрачивает количество энергии, равное лампочке мощностью в 10 Ватт. Так что образ лампочки над головой в момент возникновения интересной мысли не так уж далек от истины.

Даже если сердце человека не бьется, то он все равно может жить в течение долгого промежутка времени, что и продемонстрировал нам норвежский рыбак Ян Ревсдал. Его «мотор» остановился на 4 часа после того как рыбак заблудился и заснул в снегу.

В четырех дольках темного шоколада содержится порядка двухсот калорий. Так что если не хотите поправиться, лучше не есть больше двух долек в сутки.

Ученые из Оксфордского университета провели ряд исследований, в ходе которых пришли к выводу, что вегетарианство может быть вредно для человеческого мозга, так как приводит к снижению его массы. Поэтому ученые рекомендуют не исключать полностью из своего рациона рыбу и мясо.

Когда влюбленные целуются, каждый из них теряет 6,4 ккалорий в минуту, но при этом они обмениваются почти 300 видами различных бактерий.

Кроме людей, от простатита страдает всего одно живое существо на планете Земля – собаки. Вот уж действительно наши самые верные друзья.

Во время чихания наш организм полностью прекращает работать. Даже сердце останавливается.

Первый вибратор изобрели в 19 веке. Работал он на паровом двигателе и предназначался для лечения женской истерии.

Наши почки способны очистить за одну минуту три литра крови.

Люди, которые привыкли регулярно завтракать, гораздо реже страдают ожирением.

КОНИУМ, CONIUM MACULATUM — БОЛИГОЛОВ, ОМЕГ ПЯТНИСТЫЙ. Практическая гомеопатия

Читайте также

Conium

Conium Болиголов пятнистый.Тинктура приготовляется из цветущих верхушек растения, собранных незадолго до созревания плодов, в июле.Патогенез кониум находится в «Хронических болезнях» Ганемана.ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕИмбер-Гурбейр в серии очерков, опубликованных в

CONIUM

CONIUM История болезни 39НЕВРИТ ЗРИТЕЛЬНОГО НЕРВАПятидесятичетырехлетняя госпожа С. пришла ко мне на прием 10 апреля 1924 года за рецептом для астигматических очков.5 марта 1926 года она пришла вновь с жалобами на резкое снижение остроты зрения в последние дни после появления

27. КОНИУМ

27. КОНИУМ Conium maculatum — болиголов пятнистый.Эссенция приготавливается из сока свежего растения. Это так называемое спинномозговое средство. Оно вызывает паралич, идущий снизу вверх. Поэтому это средство против атаксии. Очень характерным признаком этого средства является

БОЛИГОЛОВ (CONIUM. CONIUM MACULATUM)

БОЛИГОЛОВ (CONIUM. CONIUM MACULATUM) Сродственные лекарства. Belladonna, Hydrastis, PhytolaccaСпецифическое действие. На всасывающие и лимфатические сосуды, на железы и органы дыхания; вторично на кожу, слизистую оболочку желудка и кишок, на матку и ее придатки.Применение. Золотушные заболевания с

Conium maculatum.

Болиголов пятнистый

Conium maculatum. Болиголов пятнистый Тип кониума — старый человек, с выраженной физической и психической астенией, мышечной слабостью и дрожанием мышц. Полнота, сменяющаяся кахексией на поздних этапах жизни. Характерны головокружения, особенно при повороте в постели, при

Conium maculatum

Conium maculatum Conium/Кониум — болиголов пятнистый Основные лекарственные формы. Гомеопатические гранулы D3, C3, C6 и выше. Капли D3, C3, C6 и выше. Мазь Кониум 5 %. Показания к применению. Головокружения у старых ослабленных лиц, усиливающиеся при смене положения тела, особенно при

Conium

Conium Пятнистый болиголовСтарое средство, ставшее классическим после знаменитого описания Платоном картины смерти Сократа. Вызывает восходящий паралич, заканчивающийся смертью от остановки движений грудной клетки и диафрагмы, — это, так сказать, «заключительный этап»

Geranium maculatum

Geranium maculatum Дикая гераньПривычные мигрени. Профузные кровотечения легочные и из различных органов. Кровавые рвоты. Язвы желудка. Атонические и гнилостные язвы. Летние жалобы.Голова. Головокружения с диплопией; улучшение при закрывании глаз. Птоз, и расширение зрачков.

21. АРОННИК ПЯТНИСТЫЙ

21. АРОННИК ПЯТНИСТЫЙ Травники привозят аронник с Северного Кавказа, из Молдовы, Украины, Западной Грузии, Абхазии.Свежие и высушенные клубни аронника используют в отварах и спиртовых настойках при заболеваниях печени, мочекаменной болезни, ревматизме, геморрое, а также

46. БОЛИГОЛОВ КРАПЧАТЫЙ

46. БОЛИГОЛОВ КРАПЧАТЫЙ Растение очень ядовитое. Древние греки давали приговорённым к смертной казни выпить сок болиголова. Амирдовлат Амасиаци писал о нём: «Это растение нельзя ни есть, ни пить его сок, ибо он лишает человека разума и убивает его. А чтобы уменьшить его

Болиголов крапчатый

Болиголов крапчатый Это двулетнее растение из семейства зонтичных. Еще в Древней Греции использовали его токсические свойства. Преступников, осужденных на смерть, заставляли пить смесь болиголова и опия, после чего наступала смерть. Болиголовом был убит в свое время и

Болиголов пятнистый

Болиголов пятнистый Слабые дозы настоек этого растения, применяемые длительное время, показали действие на молочные железы и кожу. Можно говорить о почти специфическом действии болиголова на грудные железы, в которых рассасываются опухоли и набухание. Целенаправленно

Аронник пятнистый (aram maculatum)

Аронник пятнистый (aram maculatum) Характер: холодныйВкус: сладкийЦвет: корень — коричневый; листья, стебли — темно-зеленые; плоды — красные; цветки — белыеОсновной состав: полисахариды, флавоноиды, крахмал, кумарины, эфирное маслоФармакологическое действие: БАВ растения

Болиголов пятнистый

Болиголов пятнистый Наиболее выраженной противоопухолевой активностью обладают алкалоиды кониин и метилкониин, содержащиеся в болиголове (Conium maculatum L. , сем. зонтичных). Препараты на основе болиголова пятнистого используют при различных видах онкологических

Болиголов пятнистый

Болиголов пятнистый Корневище этого растения напоминает хрен, а листья – зелень петрушки. Действующим веществом болиголова является алкалоид кониин, вызывающий паралич двигательных нервов. Для клинической картины отравления характерен паралич ног, при больших дозах

5 ноября Болиголов пятнистый

5 ноября Болиголов пятнистый Настойку болиголова применяют как болеутоляющее и противосудорожное средство. С ним делают припарки к опухолям. Из травы приготавливают ферменты на основе молочной сыворотки.Для этого на 3 л сыворотки берут полстакана травы, стакан сахара,

Кониум гомеопатия инструкция

Кониум гомеопатия инструкция

Появления плодов. Кониум по Кенту. Сырье:.пятнистый целое растение, верхушки надземной части, соцветия. Мазь Кониум 5. Поэтому это средство против атаксии. Капли 3, 3, 6 и выше. В гомеопатию введен Ганеманом в 1825 году. Инструкция по применению Кониум плюс гранулы гомеопатические фл 20г. Эссенция приготавливается из сока свежего растения. Жильбер Шаретт. Гомеопатические гранулы 3, 3, 6 и выше. Описание Кониум.

Гидрастис канаденсис гидрастис 6, 0,17 г. Кониум плюс, гранулы гомеопатические, 0 г. Фармакологическое наименование: Кониум,. В гомеопатию кониум введен доктором медицинских наук Ганеманом. Сбор осуществляется в июле месяце. Кониум болиголов пятнистый. Инструкция по применению Кониум макулатум Кониум гранулы гомеопатические разведение С30 5г. Его назначают даже. Тинктура готовится из цветущих корзинок растения, собранных незадолго до.

4 стадии рака Консультации и лечение методом гомеопатии. Аналоги Кониум макулатум Кониум гранулы гомеопатические разведение С30 5г. Болиголов крапчатый, омеграстение семейства зонтичных. Одним из распространённых в классической гомеопатии препаратов, является Кониум. Первая помощь в несчастных случаяхГомеопатические средстваКОНИУМБолиголов. калиум иодатум калиум йодатум 3, 0,17 г. Для приготовления тинктуры.

Необходимы цветущие верхушки, которые собирают за некоторое время до созревания плодов. Для изготовления гомеопатических препаратов используется цветущая верхушка болиголова. Сбор сырья производится в июле, в период цветения растения. Аналоги Кониум плюс гранулы гомеопатические фл 20г. Семейство: Зонтичные. Сырье:.пятнистыйПрименение в гомеопатии. Действующее вещество. Препарат изготовлен на основе болиголова пятнистого из семейства зонтичных. Комплекс гомеопатических веществ. Руководство. Медицинский справочник.

Кониум макулятум Практическое гомеопатическое лекарствоведение. Ввел в гомеопатию Ганеман в 1825 году. Купить Кониум макулатум. Кониум кониум макулатум или болиголов пятнистый — растение семейства зонтичных. Выпускается средство в виде гранул шаровидной формы для приема внутрь и мази для. Описание Кониум плюс гранулы гомеопатические фл 20г. Пятнистый болиголов. Двухлетнее травянистое растение до 2 м.

Макулатум Кониум гранулы гомеопатические разведение С30 5г. Его назначают даже, когда гнойная мокрота тяжело отходит или в ночное время возникает болезненный кашель, который провоцирует очень глубокие вдохи с хрипами. КОНИУМ. Описание. Показания к применению. Кониум — средство от поносов у слабых, дрожащих стариков, страдающих иногда недержанием мочи. Кониум по Берике.

Высоты. Оно вызывает паралич, идущий снизу вверх. Описан гомеопатический препаратКониум, как. Это так называемое спинномозговое средство. Фармакологическое наименование: Кониум,. В гомеопатию кониум введен доктором медицинских наук Ганеманом. Сс туя окциденталис туя 3, 0,17 г. Старое средство, ставшее классическим после знаменитого описания Платоном картины смерти Сократа. Гомеопат Григор Сергей Вадимович. Дозировка кониум при.

Вместе с

Кониум гомеопатия инструкция часто ищут

кониум гомеопатия отзывы

кониум 30 отзывы

кониум цена

кониум плюс отзывы

кониум капли

кониум 1000

кониум 6 цена

кониум популярно о гомеопатии

Читайте также:

Болеслав прус скачать все книги

Книги по тендерам скачать бесплатно

Накрутка друзей в контакте программу скачать бесплатно

Скачать моды на скайрим на реалистичную кровь

Программа для жск скачать

Взаимодействие лекарственного средства с ДНК и его способность индуцировать апоптоз посредством образования АФК

Резюме

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве народной медицины при раке шейки матки, включая гомеопатию. Однако до сих пор не проводилось систематической работы по проверке его противоракового потенциала в отношении клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кониума вызывать цитотоксичность в различных нормальных и раковых клеточных линиях, включая тщательное исследование клеток HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кониума на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), митохондриальный мембранный потенциал (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии. Способность Conium повреждать ДНК и вызывать морфологические изменения также определяли под микроскопом. Экспрессию различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, критически изучали методами вестерн-блоттинга и ELISA. Если Conium может взаимодействовать непосредственно с ДНК, также было определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (CD).

Результаты:

Обработка Conium снижала жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и подавляла пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии sub-G. Обработка кониумом приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, усилению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный каспаза-3-зависимый путь.КД-спектроскопия показала, что Conium взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и поддерживают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарство-ДНК, пролиферация, активные формы кислородаКониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N -метилкониин, конгидрин, псевдоконгидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова. Структуры этих алкалоидов показаны на а. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого схожи с никотином. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами.[2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт с давних пор используется как традиционное средство от различных заболеваний.[4] Как, например, Conium является основным средством при предстательной железе и опухании яичка. В гомеопатии он используется как лекарство от рака молочной железы и рака шейки матки, [4] но его действие еще не подтверждено научно, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК) [4]. 5] В этом исследовании мы предполагаем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium.(b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг/мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и РВМС и инкубировали в течение 48 часов. Далее в культуру HeLa вносили 70-840 мкг/мл препаратов на 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев для оценки процента жизнеспособности клеток [Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывало на снижение пролиферативной способности клеток HeLa при обработке кониумом в дозе 450 мкг/мл, а затем в контрольных планшетах через различные интервалы времени.Самая низкая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг/мл кониума) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии клеточного цикла M1=sub-G1 по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы терапия, нацеленная на ДНК, приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтезу белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз. [6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-DNA), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Экстракты трав считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов.[7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами переносимости обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. АФК также деполяризуют митохондриальный мембранный потенциал (ММП) и индуцируют апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, нам стало интересно изучить, оказывает ли он какое-либо такое противораковое действие на клетки HeLa и может ли он продуцировать АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками.[12] Поэтому ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток. [13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазы обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК.[14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, такой подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо было проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью индуцировать цитотоксичность в клетках HeLa, а также оказывает тормозящее действие на пролиферацию; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в ctDNA и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать ROS и деполяризовать MMP путем модулирования определенных клеточных сигнальных белков, связанных с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические препараты и реактивы

Модифицированная среда Игла Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотик пенициллин, стрептомицин, неомицин (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальную бычью сыворотку (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) получали от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для тканевых культур были приобретены у Tarson (Индия). Акридиновый оранжевый (АО) и бромистый этидий (ЭБ) были приобретены в SRL (Индия). 3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (MTT), йодид пропидия (PI), дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (H 2 DCFDA), 4×,6-диамидино-2- фенилиндола дигидрохлорид (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеинизотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) были собраны в Национальном центре клеточных исследований, Индия. Клетки содержали во влажном инкубаторе (ESCO, Сингапур) с кислородом окружающей среды и 5%-ным уровнем углекислого газа при 37°С. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% термоинактивированной FBS и 1% PSN. Клетки собирали с помощью 0,025% трипсина-ЭДТА в фосфатно-солевом буфере (PBS), высевали в чашках с требуемым количеством клеток и оставляли для прилипания в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque по стандартной методике и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и РВМС распределяли в 96-луночные планшеты для микротитрования с плоским дном (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 3 клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг/мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37°С. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм в считывателе ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Было обнаружено, что из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium наиболее заметна и значительно выше в HeLa, чем в других линиях раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял выраженной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и РВМС. Поэтому клетки HeLa предпочитали другим раковым клеткам как наиболее подходящий материал для проведения всех других экспериментов, связанных с их вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результатов анализа МТТ были выбраны три разные дозы, а именно: D1 = 150 мкг/мл, D2 = 300 мкг/мл и D3 = 450 мкг/мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Положительный контроль (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разбавления), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал каких-либо ощутимых различий в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного лечения принимали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa исследовали на цитотоксическое действие Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарственных средств в течение 6 часов. Затем клетки промывали предварительно нагретым до 37°С PBS (фосфатно-солевой буфер), трипсинизировали и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток/лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом.[16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и трипсинизировали.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эта процедура повторялась для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторялись трижды. После анализа данных была получена гистограмма клеточной пролиферации.

Анализ клеточного цикла

Йодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг/мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление АФК определяли количественно после инкубации 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 ч соответственно с 450 мкг/мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальных мембран

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al. . ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37°С в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37°С в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина-123 оценивали методом проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США) и анализировали данные с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг/мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. Через 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO/EB: Для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы препарата (150, 300 и 450 мкг/мл Conium). Через 48 ч обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и АО/ЭБ в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V/PI

Клетки обрабатывали 450 мкг/мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг/мл Conium соответственно) клетки HeLa промывали в PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг/мл) и протеиназа К (0,1 мг/мл)) в течение ночи, затем центрифугируют при 1200 g при 4°C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25:24:1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4°C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали 100% этанолом из водного слоя и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избыточных белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле, полосы визуализировали в УФ-светителе с последующим цифровым фотографированием.

Вестерн-блот-анализ

Клетки HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 5 клеток на лунку. Клетки обрабатывали Conium в различных концентрациях (150, 300 и 450 мкг/мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) анализировали на 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на мембрану PVDF. После блокировки 3% БСА мембраны инкубировали отдельно со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4°C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. В качестве проявителя использовали BCIP-NBT, а количественную оценку белков проводили с помощью денситометрии с использованием программного обеспечения image J.[17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ИФА

В этом эксперименте клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг/мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили в соответствии с протоколом производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома с измеряли с помощью считывателя ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность окраски измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил в этом анализе геном домашнего хозяйства.[18]

Взаимодействие препарата с ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были проведены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК клеток тимуса голого теленка (цтДНК) с концентрацией препарата 450 мкл/мл, используя необработанную цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия препарата с ДНК внутри клеток проводили инкубацию с конием в концентрации 450 мкл/мл в течение 3 часов. После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора для очистки геномной ДНК GeneiPure Mammalian, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственного средства с ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro.[19]

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с помощью однофакторного ANOVA с LSD апостериорными тестами с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения того, были ли различия значимыми среди средних значений разных групп.Результаты выражали как среднее ± SE (стандартная ошибка). * P < 0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка Conium снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa образовывать колонии

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибель клеток происходила при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг/мл на A375, HepG2 и A549 соответственно при 48-часовой обработке [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат МТТ показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличилась через 48 часов, больше, чем через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa зависело от дозы, как и у других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации препарата процент жизнеспособности снижался до 36,48 ± 1 для дозы препарата 840 мкг/мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% происходило при 722,6 ± 8,0 мкг/мл. За 48 ч инкубации препарата процент жизнеспособности клеток снижался до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг/мл, а 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при дозе 575,5 ± 5,0 мкг/мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и РВМС) показали, что кониум вызывал минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снижался до 85 ± 1,1 при обработке Conium 840 мкг/мл в течение 48 часов, а для PBMC процент жизнеспособности снижался при более высоких дозах и составлял 78,3 ± 2,4% при обработке Conium 840 мкг/мл. на 48 часов.

Результаты клоногенного анализа показали, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки кониумом (450 мкг/мл) колониеобразующая способность снижалась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти результаты позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний клеток HeLa [].

Обработка кониумом снижала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла

Обработка кониумом снижала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение кониумом не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ч ч пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 ч лечения [].

Признаки остановки клеточного цикла были обнаружены в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг/мл кониума) наблюдалось резкое увеличение клеточной популяции в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, что указывает на то, что индукция фрагментации ДНК устанавливалась через 24 и 48 ч [].

Обработка Conium инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Генерация АФК: это исследование, зависящее от времени, выявило накопление АФК при лечении препаратом (450 мкг/мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывало на накопление АФК.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию MMP. Исследования FACS показали, что пики смещены к оси y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования

Обработка конием деполяризует потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения выявили снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация зависела от дозы, и максимальная деполяризация наблюдалась при лечении кониумом в дозе 450 мкг/мл [].

Обработка Conium вызывала морфологические изменения в клетках HeLa с фрагментацией нуклеосом

В клетках HeLa при обработке Conium наблюдались морфологические изменения с округлением цитоплазматической периферии с постепенным отрывом клеток от субстрата. Особенности включали вздутие клеточной мембраны и сморщивание клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдалась в окрашенных AO/EB клетках по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый свидетельствует об индукции апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], фрагментация была наибольшей при дозе Conium 450 мкг/мл.

Определение апоптоза: Клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг/мл Conium в течение 48 часов. ( а ) Морфологический анализ: результат показал вздутие клеточной мембраны и сморщивание клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO/EB: ядерная конденсация и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый свидетельствует об индукции апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальная степень фрагментации нуклеосом наблюдалась при дозе Conium 450 мкг/мл, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов после обработки. Точечный график свидетельствует о присутствии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [Вверху слева = мертвые клетки, внизу слева = живые клетки, вверху справа = клетки с поздним апоптозом и справа внизу = клетки с ранним апоптозом]. (e) Анализ фрагментации ДНК: Наличие фрагментации наблюдали в клетках, обработанных Conium, через 48 часов после обработки.Фрагментация была наибольшей при самой высокой дозе

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина в плазматической мембране с инициацией фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза было выполнено посредством оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V/PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг/мл). Клетки демонстрировали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на клеточную поверхность [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, получавшей Conium [].

Лечение Conium модулировало экспрессию различных белков, связанных с клеточной пролиферацией и апоптозом в клетках HeLa.

Лечение Conium повышало экспрессию определенных белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозах препарата 150, 300 и 450 мкг/мл соответственно. Экспрессия Bax повышалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе препарата, а активность TNF-α также усиливалась при лечении Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг/мл соответственно.Лечение кониумом усиливало расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при самой высокой дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 указывают на индукцию апоптоза в клетках, обработанных Conium [].

(a) Вестерн-блоттинг-анализ: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt подавлялась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась при обработке Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) Анализ ELISA: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции при лечении лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет экспрессирующую активность цитохрома с с точки зрения значений оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Экспрессия нативного Akt вместе с его активированной формой pAkt подавлялась обработкой конием. Отношения pAkt/Akt уменьшились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг/мл для обработки Conium соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также снижалась примерно на 23%, а экспрессия NFkB также снижалась примерно на 28% при обработке Conium в клетках HeLa [рис. 6]. GAPDH служил контролем нагрузки [].

Анализ ELISA на цитохром с показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Кониум-индуцированные спектральные изменения кругового дихроизма как в ct-ДНК, так и в ДНК HeLa клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В ct-ДНК, обработанной Conium, и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составляли 262 (+4) и 255 (0) соответственно, а для отрицательных полос составляли 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium, в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие препарата с ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (а) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения препарата решил провести дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что направленная на ДНК терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, предполагая, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум повышал активность АФК в первые часы в клетках HeLa.Это событие может проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в клетках, обработанных Conium. Обработка кониумом снижала жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени/дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением клеточной популяции в аннексин V-позитивном/PI-негативном квадранте, что подтверждает способность кониума индуцировать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 ч после обработки; одновременно скорость роста клеток снижалась с увеличением клеточной популяции в фазе суб-G1 после лечения кониумом, что еще раз подтверждает роль кониума в остановке клеточного деления, демонстрируя его ингибирующее рост действие на раковые клетки. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком, называемым pAkt/Akt.[23] Введение препарата снижало уровень pAkt/Akt и, предположительно, приводило к состоянию, которое приводило к уменьшению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, демонстрирующих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа МТТ также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы препарата, но такого состояния не наблюдалось в случае WRL-68 и РВМС. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO/EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV/PI. В наших выводах увеличение популяции клеток, находящихся в состоянии раннего апоптоза (о чем свидетельствуют клетки с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных группах, получавших лекарственное средство.Таким образом, были получены четкие доказательства того, что препарат может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после обработки.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать большую чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров опухолей, таких как p53.[13] Экспрессия p53 повышалась наряду с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. При остановке роста экспрессия Akt/pAkt, важной клеточной дифференцировки и пролиферативной молекулы [12], подавлялась.Одна из гипотез, объясняющая это событие, может заключаться в том, что после индукции лекарственного средства имели место перекрестные помехи p53-Akt.

Накопление АФК и деполяризация ММП являются одновременными процессами [24], приводящими к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз через внутренний путь [26]. В нашем исследовании при лечении препаратом происходила деполяризация ММП с увеличением цитозольного цитохрома с. Это может указывать на то, что раннее повышение АФК играет роль регуляторного механизма для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax регулируется белком-супрессором опухоли p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпел конформационный сдвиг, чтобы стать связанным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз.[26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и, таким образом, может нейтрализовать его проапоптотический эффект. Таким образом, изменение уровней Bax и Bcl-2, то есть соотношение Bcl-2/Bax, является решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток.[27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

АФК участвуют в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α является фактором или рецептором, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ.[28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижележащем уровне [29]. Наши результаты показали положительную регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 ниже по течению, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие препарата с ДНК и его способность индуцировать апоптоз посредством образования АФК

Резюме

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве народной медицины при раке шейки матки, включая гомеопатию. Однако до сих пор не проводилось систематической работы по проверке его противоракового потенциала в отношении клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кониума вызывать цитотоксичность в различных нормальных и раковых клеточных линиях, включая тщательное исследование клеток HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кониума на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), митохондриальный мембранный потенциал (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Способность Conium повреждать ДНК и вызывать морфологические изменения также определяли под микроскопом. Экспрессию различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, критически изучали методами вестерн-блоттинга и ELISA. Если Conium может взаимодействовать непосредственно с ДНК, также было определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (CD).

Результаты:

Обработка Conium снижала жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и подавляла пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии sub-G. Обработка кониумом приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, усилению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный каспаза-3-зависимый путь. КД-спектроскопия показала, что Conium взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и поддерживают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарство-ДНК, пролиферация, активные формы кислорода Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N -метилкониин, конгидрин, псевдоконгидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова. [1] Структуры этих алкалоидов показаны на а. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого схожи с никотином. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами.[2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт уже давно используется в качестве традиционного средства от различных заболеваний.[4] Как, например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичка. В гомеопатии он используется как лекарство от рака молочной железы и рака шейки матки,[4] но его действие еще не подтверждено научно, за исключением сообщений о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы предполагаем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг/мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и РВМС и инкубировали в течение 48 часов. Далее в культуру HeLa вносили 70-840 мкг/мл препаратов на 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев для оценки процента жизнеспособности клеток [Значимость * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывало на снижение пролиферативной способности клеток HeLa при обработке кониумом в дозе 450 мкг/мл, а затем в контрольных планшетах через различные интервалы времени. Самая низкая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг/мл кониума) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии клеточного цикла M1=sub-G1 по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы терапия, нацеленная на ДНК, приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтезу белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-DNA), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Экстракты трав считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов.[7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами переносимости обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. АФК также деполяризуют митохондриальный мембранный потенциал (ММР) и индуцируют апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, нам стало интересно изучить, оказывает ли он какое-либо такое противораковое действие на клетки HeLa и может ли он продуцировать АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками.[12] Поэтому ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазы обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК.[14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, такой подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо было проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью индуцировать цитотоксичность в клетках HeLa, а также оказывает тормозящее действие на пролиферацию; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в ctDNA и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать ROS и деполяризовать MMP путем модулирования определенных клеточных сигнальных белков, связанных с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические препараты и реактивы

Модифицированная среда Игла Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотик пенициллин, стрептомицин, неомицин (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальную бычью сыворотку (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) получали от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для тканевых культур были приобретены у Tarson (Индия). Акридиновый оранжевый (АО) и бромистый этидий (ЭБ) были приобретены в SRL (Индия). 3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (MTT), йодид пропидия (PI), дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (H 2 DCFDA), 4×,6-диамидино-2- фенилиндола дигидрохлорид (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеинизотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) были собраны в Национальном центре клеточных исследований, Индия. Клетки содержали во влажном инкубаторе (ESCO, Сингапур) с кислородом окружающей среды и 5%-ным уровнем углекислого газа при 37°С. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% термоинактивированной FBS и 1% PSN.Клетки собирали с помощью 0,025% трипсина-ЭДТА в фосфатно-солевом буфере (PBS), высевали в чашках с требуемым количеством клеток и оставляли прикрепляться в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque по стандартной методике и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и РВМС распределяли в 96-луночные планшеты для микротитрования с плоским дном (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 3 клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг/мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37°С. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм в считывателе ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Было обнаружено, что из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium наиболее заметна и значительно выше в HeLa, чем в других линиях раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял выраженной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и РВМС. Поэтому клетки HeLa предпочитали другим раковым клеткам как наиболее подходящий материал для проведения всех других экспериментов, связанных с их вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результатов анализа МТТ были выбраны три разные дозы, а именно: D1 = 150 мкг/мл, D2 = 300 мкг/мл и D3 = 450 мкг/мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Положительный контроль (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разбавления), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал каких-либо ощутимых различий в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного лечения принимали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa исследовали на цитотоксическое действие Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарственных средств в течение 6 часов. Затем клетки промывали предварительно нагретым до 37°С PBS (фосфатно-солевой буфер), трипсинизировали и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток/лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом.[16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и трипсинизировали.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эта процедура повторялась для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторялись трижды. После анализа данных была получена гистограмма клеточной пролиферации.

Анализ клеточного цикла

Йодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг/мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление АФК определяли количественно после инкубации 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 ч соответственно с 450 мкг/мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальных мембран

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al. . ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37°С в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37°С в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина-123 оценивали методом проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США) и анализировали данные с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг/мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. Через 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO/EB: Для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы препарата (150, 300 и 450 мкг/мл Conium). Через 48 ч обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и АО/ЭБ в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V/PI

Клетки обрабатывали 450 мкг/мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг/мл Conium соответственно) клетки HeLa промывали в PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг/мл) и протеиназа К (0,1 мг/мл)) в течение ночи, затем центрифугируют при 1200 g при 4°C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25:24:1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4°C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали 100% этанолом из водного слоя и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избыточных белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле, полосы визуализировали в УФ-светителе с последующим цифровым фотографированием.

Вестерн-блот-анализ

Клетки HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 5 клеток на лунку. Клетки обрабатывали Conium в различных концентрациях (150, 300 и 450 мкг/мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) анализировали на 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на мембрану PVDF. После блокировки 3% БСА мембраны инкубировали отдельно со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4°C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. В качестве проявителя использовали BCIP-NBT, а количественную оценку белков проводили с помощью денситометрии с использованием программного обеспечения image J.[17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ИФА

В этом эксперименте клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг/мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили в соответствии с протоколом производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома с измеряли с помощью считывателя ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность окраски измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил в этом анализе геном домашнего хозяйства.[18]

Взаимодействие препарата с ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были проведены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК клеток тимуса голого теленка (цтДНК) с концентрацией препарата 450 мкл/мл, используя необработанную цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия препарата с ДНК внутри клеток проводили инкубацию с конием в концентрации 450 мкл/мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора для очистки геномной ДНК GeneiPure Mammalian, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственного средства с ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro.[19]

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с помощью однофакторного ANOVA с LSD апостериорными тестами с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения того, были ли различия значимыми среди средних значений разных групп.Результаты выражали как среднее ± SE (стандартная ошибка). * P < 0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa образовывать колонии

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что кониум снижает жизнеспособность клеток A375, HepG2 и A549. 50% гибель клеток происходила при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг/мл на A375, HepG2 и A549 соответственно при 48-часовой обработке [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат МТТ показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличилась через 48 часов, больше, чем через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa зависело от дозы, как и у других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации препарата процент жизнеспособности снижался до 36,48 ± 1 для дозы препарата 840 мкг/мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% происходило при 722,6 ± 8,0 мкг/мл. За 48 ч инкубации препарата процент жизнеспособности клеток снижался до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг/мл, а 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при дозе 575,5 ± 5,0 мкг/мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и РВМС) показали, что кониум вызывал минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снижался до 85 ± 1,1 при обработке Conium 840 мкг/мл в течение 48 часов, а для PBMC процент жизнеспособности снижался при более высоких дозах и составлял 78,3 ± 2,4% при обработке Conium 840 мкг/мл. на 48 часов.

Результаты клоногенного анализа показали, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки кониумом (450 мкг/мл) колониеобразующая способность снижалась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти результаты позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний клеток HeLa [].

Обработка кониумом снижала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла

Обработка кониумом снижала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение кониумом не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ч ч пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 ч лечения [].

Признаки остановки клеточного цикла были обнаружены в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг/мл кониума) наблюдалось резкое увеличение клеточной популяции в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, что указывает на то, что индукция фрагментации ДНК устанавливалась через 24 и 48 ч [].

Обработка Conium инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Генерация АФК: это исследование, зависящее от времени, выявило накопление АФК при лечении препаратом (450 мкг/мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывало на накопление АФК.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию MMP. Исследования FACS показали, что пики смещены к оси Y по сравнению с контролем, подтверждая результаты микроскопического исследования

Обработка конием деполяризованных потенциалов митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения выявили снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация зависела от дозы, и максимальная деполяризация наблюдалась при лечении кониумом в дозе 450 мкг/мл [].

Обработка Conium вызывала морфологические изменения в клетках HeLa с фрагментацией нуклеосом

В клетках HeLa при обработке Conium наблюдались морфологические изменения с округлением цитоплазматической периферии с постепенным отрывом клеток от субстрата. Особенности включали вздутие клеточной мембраны и сморщивание клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдалась в окрашенных AO/EB клетках по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый свидетельствует об индукции апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], фрагментация была наибольшей при дозе Conium 450 мкг/мл.

Определение апоптоза: Клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг/мл Conium в течение 48 часов. ( а ) Морфологический анализ: результат показал вздутие клеточной мембраны и сморщивание клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO/EB: ядерная конденсация и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый свидетельствует об индукции апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальная степень фрагментации нуклеосом наблюдалась при дозе Conium 450 мкг/мл, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов после обработки. Точечный график свидетельствует о присутствии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [Вверху слева = мертвые клетки, внизу слева = живые клетки, вверху справа = клетки с поздним апоптозом и справа внизу = клетки с ранним апоптозом]. (e) Анализ фрагментации ДНК: Наличие фрагментации наблюдали в клетках, обработанных Conium, через 48 часов после обработки.Фрагментация была наибольшей при самой высокой дозе

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина в плазматической мембране с инициацией фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза было выполнено посредством оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V/PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг/мл). Клетки демонстрировали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на клеточную поверхность [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, получавшей Conium [].

Лечение Conium модулировало экспрессию различных белков, связанных с клеточной пролиферацией и апоптозом в клетках HeLa.

Лечение Conium повышало экспрессию определенных белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозах препарата 150, 300 и 450 мкг/мл соответственно. Экспрессия Bax повышалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе препарата, а активность TNF-α также усиливалась при лечении Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг/мл соответственно.Лечение кониумом усиливало расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при самой высокой дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 указывают на индукцию апоптоза в клетках, обработанных Conium [].

(a) Вестерн-блоттинг-анализ: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt подавлялась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась при обработке Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) Анализ ELISA: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции при лечении лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет экспрессирующую активность цитохрома с с точки зрения значений оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Экспрессия нативного Akt вместе с его активированной формой pAkt подавлялась обработкой конием.Отношения pAkt/Akt уменьшились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг/мл для обработки Conium соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также снижалась примерно на 23%, а экспрессия NFkB также снижалась примерно на 28% при обработке Conium в клетках HeLa [рис. 6]. GAPDH служил контролем нагрузки [].

Анализ ELISA на цитохром с показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Кониум-индуцированные спектральные изменения кругового дихроизма как в ct-ДНК, так и в ДНК HeLa клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В ct-ДНК, обработанной Conium, и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составляли 262 (+4) и 255 (0) соответственно, а для отрицательных полос составляли 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium, в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие препарата с ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (а) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения препарата решил провести дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что направленная на ДНК терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, предполагая, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум повышал активность АФК в первые часы в клетках HeLa.Это событие может проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в клетках, обработанных Conium. Обработка кониумом снижала жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени/дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением клеточной популяции в аннексин V-позитивном/PI-негативном квадранте, что подтверждает способность кониума индуцировать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 ч после обработки; одновременно скорость роста клеток снижалась с увеличением клеточной популяции в фазе суб-G1 после лечения кониумом, что еще раз подтверждает роль кониума в остановке клеточного деления, демонстрируя его ингибирующее рост действие на раковые клетки. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком, называемым pAkt/Akt.[23] Введение препарата снижало уровень pAkt/Akt и, предположительно, приводило к состоянию, которое приводило к уменьшению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, демонстрирующих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа МТТ также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы препарата, но такого состояния не наблюдалось в случае WRL-68 и РВМС. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO/EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV/PI. В наших выводах увеличение популяции клеток, находящихся в состоянии раннего апоптоза (о чем свидетельствуют клетки с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных группах, получавших лекарственное средство.Таким образом, были получены четкие доказательства того, что препарат может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после обработки.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать большую чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров опухолей, таких как p53.[13] Экспрессия p53 повышалась наряду с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. При остановке роста экспрессия Akt/pAkt, важной клеточной дифференцировки и пролиферативной молекулы [12], подавлялась.Одна из гипотез, объясняющая это событие, может заключаться в том, что после индукции лекарственного средства имели место перекрестные помехи p53-Akt.

Накопление АФК и деполяризация ММП являются одновременными процессами [24], приводящими к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз через внутренний путь [26]. В нашем исследовании при лечении препаратом происходила деполяризация ММП с увеличением цитозольного цитохрома с. Это может указывать на то, что раннее повышение АФК играет роль регуляторного механизма для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax регулируется белком-супрессором опухоли p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпел конформационный сдвиг, чтобы стать связанным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз.[26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и, таким образом, может нейтрализовать его проапоптотический эффект.Таким образом, изменение уровней Bax и Bcl-2, то есть соотношение Bcl-2/Bax, является решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток.[27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

АФК участвуют в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α является фактором или рецептором, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ.[28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижележащем уровне [29]. Наши результаты показали положительную регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 ниже по течению, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие препарата с ДНК и его способность индуцировать апоптоз посредством образования АФК

Резюме

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве народной медицины при раке шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по проверке его противоракового потенциала в отношении клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кониума вызывать цитотоксичность в различных нормальных и раковых клеточных линиях, включая тщательное исследование клеток HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кониума на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), митохондриальный мембранный потенциал (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Способность Conium повреждать ДНК и вызывать морфологические изменения также определяли под микроскопом. Экспрессию различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, критически изучали методами вестерн-блоттинга и ELISA. Если Conium может взаимодействовать непосредственно с ДНК, также было определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (CD).

Результаты:

Обработка Conium снижала жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и подавляла пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии sub-G.Обработка кониумом приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, усилению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный каспаза-3-зависимый путь. КД-спектроскопия показала, что Conium взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и поддерживают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарство-ДНК, пролиферация, активные формы кислорода Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N -метилкониин, конгидрин, псевдоконгидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на а. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого схожи с никотином. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами.[2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт уже давно используется в качестве традиционного средства от различных заболеваний.[4] Как, например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичка. В гомеопатии он используется как лекарство от рака молочной железы и рака шейки матки,[4] но его действие еще не подтверждено научно, за исключением сообщений о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы предполагаем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг/мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и РВМС и инкубировали в течение 48 часов. Далее в культуру HeLa вносили 70-840 мкг/мл препаратов на 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев для оценки процента жизнеспособности клеток [Значимость * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывало на снижение пролиферативной способности клеток HeLa при обработке кониумом в дозе 450 мкг/мл, а затем в контрольных планшетах через различные интервалы времени. Самая низкая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг/мл кониума) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии клеточного цикла M1=sub-G1 по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы терапия, нацеленная на ДНК, приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтезу белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-DNA), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Экстракты трав считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов.[7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами переносимости обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. АФК также деполяризуют митохондриальный мембранный потенциал (ММП) и индуцируют апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, нам стало интересно изучить, оказывает ли он какое-либо такое противораковое действие на клетки HeLa и может ли он продуцировать АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками.[12] Поэтому ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазы обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК.[14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, такой подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо было проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью индуцировать цитотоксичность в клетках HeLa, а также оказывает тормозящее действие на пролиферацию; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в ctDNA и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать ROS и деполяризовать MMP путем модулирования определенных клеточных сигнальных белков, связанных с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические препараты и реактивы

Модифицированная среда Игла Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотик пенициллин, стрептомицин, неомицин (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальную бычью сыворотку (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) получали от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для тканевых культур были приобретены у Tarson (Индия). Акридиновый оранжевый (АО) и бромистый этидий (ЭБ) были приобретены в SRL (Индия). 3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (MTT), йодид пропидия (PI), дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (H 2 DCFDA), 4×,6-диамидино-2- фенилиндола дигидрохлорид (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеинизотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) были собраны в Национальном центре клеточных исследований, Индия. Клетки содержали во влажном инкубаторе (ESCO, Сингапур) с кислородом окружающей среды и 5%-ным уровнем углекислого газа при 37°С. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% термоинактивированной FBS и 1% PSN.Клетки собирали с помощью 0,025% трипсина-ЭДТА в фосфатно-солевом буфере (PBS), высевали в чашках с требуемым количеством клеток и оставляли для прилипания в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque по стандартной методике и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и РВМС распределяли в 96-луночные планшеты для микротитрования с плоским дном (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 3 клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг/мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37°С. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм в считывателе ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Было обнаружено, что из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium наиболее заметна и значительно выше в HeLa, чем в других линиях раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял выраженной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и РВМС. Поэтому клетки HeLa предпочитали другим раковым клеткам как наиболее подходящий материал для проведения всех других экспериментов, связанных с их вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результатов анализа МТТ были выбраны три разные дозы, а именно: D1 = 150 мкг/мл, D2 = 300 мкг/мл и D3 = 450 мкг/мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Положительный контроль (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разбавления), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал каких-либо ощутимых различий в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного лечения принимали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa исследовали на цитотоксическое действие Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарственных средств в течение 6 часов. Затем клетки промывали предварительно нагретым до 37°С PBS (фосфатно-солевой буфер), трипсинизировали и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток/лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом.[16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и трипсинизировали.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эта процедура повторялась для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторялись трижды. После анализа данных была получена гистограмма клеточной пролиферации.

Анализ клеточного цикла

Йодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг/мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление АФК определяли количественно после инкубации 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 ч соответственно с 450 мкг/мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальных мембран

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al. . ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37°С в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37°С в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина-123 оценивали методом проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США) и анализировали данные с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг/мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. Через 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO/EB: Для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы препарата (150, 300 и 450 мкг/мл Conium). Через 48 ч обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и АО/ЭБ в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V/PI

Клетки обрабатывали 450 мкг/мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг/мл Conium соответственно) клетки HeLa промывали в PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг/мл) и протеиназа К (0,1 мг/мл)) в течение ночи, затем центрифугируют при 1200 g при 4°C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25:24:1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4°C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали 100% этанолом из водного слоя и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избыточных белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле, полосы визуализировали в УФ-светителе с последующим цифровым фотографированием.

Вестерн-блот-анализ

Клетки HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 5 клеток на лунку. Клетки обрабатывали Conium в различных концентрациях (150, 300 и 450 мкг/мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) анализировали на 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на мембрану PVDF. После блокировки 3% БСА мембраны инкубировали отдельно со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4°C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. В качестве проявителя использовали BCIP-NBT, а количественную оценку белков проводили с помощью денситометрии с использованием программного обеспечения image J.[17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ИФА

В этом эксперименте клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг/мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили в соответствии с протоколом производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома с измеряли с помощью считывателя ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность окраски измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил в этом анализе геном домашнего хозяйства.[18]

Взаимодействие препарата с ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были проведены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК клеток тимуса голого теленка (цтДНК) с концентрацией препарата 450 мкл/мл, используя необработанную цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия препарата с ДНК внутри клеток проводили инкубацию с конием в концентрации 450 мкл/мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора для очистки геномной ДНК GeneiPure Mammalian, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственного средства с ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro.[19]

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с помощью одностороннего ANOVA с LSD апостериорными тестами с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения того, были ли различия значимыми среди средних значений разных групп.Результаты выражали как среднее ± SE (стандартная ошибка). * P < 0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка Conium снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa образовывать колонии

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибель клеток происходила при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг/мл на A375, HepG2 и A549 соответственно при 48-часовой обработке [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат МТТ показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличилась через 48 часов, больше, чем через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa зависело от дозы, как и у других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации препарата процент жизнеспособности снижался до 36,48 ± 1 для дозы препарата 840 мкг/мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% происходило при 722,6 ± 8,0 мкг/мл. За 48 ч инкубации препарата процент жизнеспособности клеток снижался до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг/мл, а 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при дозе 575,5 ± 5,0 мкг/мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и РВМС) показали, что кониум вызывал минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снижался до 85 ± 1,1 при обработке Conium 840 мкг/мл в течение 48 часов, а для PBMC процент жизнеспособности снижался при более высоких дозах и составлял 78,3 ± 2,4% при обработке Conium 840 мкг/мл. на 48 часов.

Результаты клоногенного анализа показали, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки кониумом (450 мкг/мл) колониеобразующая способность снижалась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти результаты позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний клеток HeLa [].

Обработка кониумом снижала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла

Обработка кониумом снижала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение кониумом не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ч ч пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 ч лечения [].

Признаки остановки клеточного цикла были обнаружены в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг/мл кониума) наблюдалось резкое увеличение клеточной популяции в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, что указывает на то, что индукция фрагментации ДНК устанавливалась через 24 и 48 ч [].

Обработка Conium инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Генерация АФК: это исследование, зависящее от времени, выявило накопление АФК при лечении препаратом (450 мкг/мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывало на накопление АФК.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию MMP. Исследования FACS показали, что пики смещены к оси Y по сравнению с контролем, подтверждая результаты микроскопического исследования

Обработка конием деполяризованных потенциалов митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения выявили снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация зависела от дозы, и максимальная деполяризация наблюдалась при лечении кониумом в дозе 450 мкг/мл [].

Обработка Conium вызывала морфологические изменения в клетках HeLa с фрагментацией нуклеосом

В клетках HeLa при обработке Conium наблюдались морфологические изменения с округлением цитоплазматической периферии с постепенным отрывом клеток от субстрата. Особенности включали вздутие клеточной мембраны и сморщивание клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдалась в окрашенных AO/EB клетках по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый свидетельствует об индукции апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], фрагментация была наибольшей при дозе Conium 450 мкг/мл.

Определение апоптоза: Клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг/мл Conium в течение 48 часов. ( а ) Морфологический анализ: результат показал вздутие клеточной мембраны и сморщивание клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO/EB: ядерная конденсация и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый свидетельствует об индукции апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальная степень фрагментации нуклеосом наблюдалась при дозе Conium 450 мкг/мл, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов после обработки. Точечный график свидетельствует о присутствии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [Вверху слева = мертвые клетки, внизу слева = живые клетки, вверху справа = клетки с поздним апоптозом и справа внизу = клетки с ранним апоптозом]. (e) Анализ фрагментации ДНК: Наличие фрагментации наблюдали в клетках, обработанных Conium, через 48 часов после обработки.Фрагментация была наибольшей при самой высокой дозе

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина в плазматической мембране с инициацией фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза было выполнено посредством оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V/PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг/мл). Клетки демонстрировали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на клеточную поверхность [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, получавшей Conium [].

Лечение Conium модулировало экспрессию различных белков, связанных с клеточной пролиферацией и апоптозом в клетках HeLa.

Лечение Conium повышало экспрессию определенных белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозах препарата 150, 300 и 450 мкг/мл соответственно. Экспрессия Bax повышалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе препарата, а активность TNF-α также усиливалась при лечении Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг/мл соответственно.Лечение кониумом усиливало расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при самой высокой дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 указывают на индукцию апоптоза в клетках, обработанных Conium [].

(a) Вестерн-блоттинг-анализ: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt подавлялась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась при обработке Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) Анализ ELISA: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции при лечении лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет экспрессирующую активность цитохрома с с точки зрения значений оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Экспрессия нативного Akt вместе с его активированной формой pAkt подавлялась обработкой конием.Отношения pAkt/Akt уменьшились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг/мл для обработки Conium соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также снижалась примерно на 23%, а экспрессия NFkB также снижалась примерно на 28% при обработке Conium в клетках HeLa [рис. 6]. GAPDH служил контролем нагрузки [].

Анализ ELISA на цитохром с показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Кониум-индуцированные спектральные изменения кругового дихроизма как в ct-ДНК, так и в ДНК HeLa клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В ct-ДНК, обработанной Conium, и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составляли 262 (+4) и 255 (0) соответственно, а для отрицательных полос составляли 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium, в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие препарата с ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (а) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения препарата решил провести дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что направленная на ДНК терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, предполагая, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум повышал активность АФК в первые часы в клетках HeLa.Это событие может проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в клетках, обработанных Conium. Обработка кониумом снижала жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени/дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением клеточной популяции в аннексин V-позитивном/PI-негативном квадранте, что подтверждает способность кониума индуцировать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 ч после обработки; одновременно скорость роста клеток снижалась с увеличением клеточной популяции в фазе суб-G1 после лечения кониумом, что еще раз подтверждает роль кониума в остановке клеточного деления, демонстрируя его ингибирующее рост действие на раковые клетки. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком, называемым pAkt/Akt.[23] Введение препарата снижало уровень pAkt/Akt и, предположительно, приводило к состоянию, которое приводило к уменьшению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, демонстрирующих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа МТТ также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы препарата, но такого состояния не наблюдалось в случае WRL-68 и РВМС. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO/EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV/PI. В наших выводах увеличение популяции клеток, находящихся в состоянии раннего апоптоза (о чем свидетельствуют клетки с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных группах, получавших лекарственное средство.Таким образом, были получены четкие доказательства того, что препарат может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после обработки.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать большую чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров опухолей, таких как p53.[13] Экспрессия p53 повышалась наряду с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. При остановке роста экспрессия Akt/pAkt, важной клеточной дифференцировки и пролиферативной молекулы [12], подавлялась.Одна из гипотез, объясняющая это событие, может заключаться в том, что после индукции лекарственного средства имели место перекрестные помехи p53-Akt.

Накопление АФК и деполяризация ММП являются одновременными процессами [24], приводящими к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз через внутренний путь [26]. В нашем исследовании при лечении препаратом происходила деполяризация ММП с увеличением цитозольного цитохрома с. Это может указывать на то, что раннее повышение АФК играет роль регуляторного механизма для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax регулируется белком-супрессором опухоли p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпел конформационный сдвиг, чтобы стать связанным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз.[26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и, таким образом, может нейтрализовать его проапоптотический эффект.Таким образом, изменение уровней Bax и Bcl-2, то есть соотношение Bcl-2/Bax, является решающим фактором, играющим важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток.[27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

АФК участвуют в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α является фактором или рецептором, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ.[28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижележащем уровне [29]. Наши результаты показали положительную регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 ниже по течению, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие препарата с ДНК и его способность индуцировать апоптоз посредством образования АФК

Резюме

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве народной медицины при раке шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по проверке его противоракового потенциала в отношении клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кониума вызывать цитотоксичность в различных нормальных и раковых клеточных линиях, включая тщательное исследование клеток HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кониума на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), митохондриальный мембранный потенциал (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Способность Conium повреждать ДНК и вызывать морфологические изменения также определяли под микроскопом. Экспрессию различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, критически изучали методами вестерн-блоттинга и ELISA. Если Conium может взаимодействовать непосредственно с ДНК, также было определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (CD).

Результаты:

Обработка кониумом снижала жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибировала пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии sub-G.Обработка кониумом приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, усилению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный каспаза-3-зависимый путь. КД-спектроскопия показала, что Conium взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и поддерживают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарство-ДНК, пролиферация, активные формы кислорода Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N -метилкониин, конгидрин, псевдоконгидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на а. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого схожи с никотином. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами.[2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт уже давно используется в качестве традиционного средства от различных заболеваний.[4] Как, например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичка. В гомеопатии он используется как лекарство от рака молочной железы и рака шейки матки,[4] но его действие еще не подтверждено научно, за исключением сообщений о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы предполагаем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг/мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и РВМС и инкубировали в течение 48 часов. Далее в культуру HeLa вносили 70-840 мкг/мл препаратов на 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев для оценки процента жизнеспособности клеток [Значимость * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывало на снижение пролиферативной способности клеток HeLa при обработке кониумом в дозе 450 мкг/мл, а затем в контрольных планшетах через различные интервалы времени. Самая низкая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг/мл кониума) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии клеточного цикла M1=sub-G1 по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы терапия, нацеленная на ДНК, приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтезу белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-DNA), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Экстракты трав считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов.[7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами переносимости обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. АФК также деполяризуют митохондриальный мембранный потенциал (ММР) и индуцируют апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, нам стало интересно изучить, оказывает ли он какое-либо такое противораковое действие на клетки HeLa и может ли он продуцировать АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками.[12] Поэтому ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазы обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК.[14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, такой подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо было проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью индуцировать цитотоксичность в клетках HeLa, а также оказывает тормозящее действие на пролиферацию; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в ctDNA и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать ROS и деполяризовать MMP путем модулирования определенных клеточных сигнальных белков, связанных с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические препараты и реактивы

Модифицированная среда Игла Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотик пенициллин, стрептомицин, неомицин (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальную бычью сыворотку (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) получали от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для тканевых культур были приобретены у Tarson (Индия). Акридиновый оранжевый (АО) и бромистый этидий (ЭБ) были приобретены в SRL (Индия). 3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (MTT), йодид пропидия (PI), дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (H 2 DCFDA), 4×,6-диамидино-2- фенилиндола дигидрохлорид (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеинизотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) были собраны в Национальном центре клеточных исследований, Индия. Клетки содержали во влажном инкубаторе (ESCO, Сингапур) с кислородом окружающей среды и 5%-ным уровнем углекислого газа при 37°С. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% термоинактивированной FBS и 1% PSN.Клетки собирали с помощью 0,025% трипсина-ЭДТА в фосфатно-солевом буфере (PBS), высевали в чашках с требуемым количеством клеток и оставляли прикрепляться в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque по стандартной методике и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и РВМС распределяли в 96-луночные планшеты для микротитрования с плоским дном (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 3 клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг/мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37°С. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм в считывателе ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Было обнаружено, что из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium наиболее заметна и значительно выше в HeLa, чем в других линиях раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял выраженной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и РВМС. Поэтому клетки HeLa предпочитали другим раковым клеткам как наиболее подходящий материал для проведения всех других экспериментов, связанных с их вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результатов анализа МТТ были выбраны три разные дозы, а именно: D1 = 150 мкг/мл, D2 = 300 мкг/мл и D3 = 450 мкг/мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Положительный контроль (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разбавления), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал каких-либо ощутимых различий в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного лечения принимали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa исследовали на цитотоксическое действие Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарственных средств в течение 6 часов. Затем клетки промывали предварительно нагретым до 37°С PBS (фосфатно-солевой буфер), трипсинизировали и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток/лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом.[16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и трипсинизировали.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эта процедура повторялась для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторялись трижды. После анализа данных была получена гистограмма клеточной пролиферации.

Анализ клеточного цикла

Йодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг/мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление АФК определяли количественно после инкубации 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 ч соответственно с 450 мкг/мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальных мембран

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al. . ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37°С в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37°С в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина-123 оценивали методом проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США) и анализировали данные с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг/мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. Через 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO/EB: Для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы препарата (150, 300 и 450 мкг/мл Conium). Через 48 ч обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и АО/ЭБ в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V/PI

Клетки обрабатывали 450 мкг/мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг/мл Conium соответственно) клетки HeLa промывали в PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг/мл) и протеиназа К (0,1 мг/мл)) в течение ночи, затем центрифугируют при 1200 g при 4°C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25:24:1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4°C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали 100% этанолом из водного слоя и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избыточных белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле, полосы визуализировали в УФ-светителе с последующим цифровым фотографированием.

Вестерн-блот-анализ

Клетки HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 5 клеток на лунку. Клетки обрабатывали Conium в различных концентрациях (150, 300 и 450 мкг/мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) анализировали на 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на мембрану PVDF. После блокировки 3% БСА мембраны инкубировали отдельно со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4°C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. В качестве проявителя использовали BCIP-NBT, а количественную оценку белков проводили с помощью денситометрии с использованием программного обеспечения image J.[17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ИФА

В этом эксперименте клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг/мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили в соответствии с протоколом производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома с измеряли с помощью считывателя ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность окраски измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил в этом анализе геном домашнего хозяйства.[18]

Взаимодействие препарата с ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были проведены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК клеток тимуса голого теленка (цтДНК) с концентрацией препарата 450 мкл/мл, используя необработанную цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия препарата с ДНК внутри клеток проводили инкубацию с конием в концентрации 450 мкл/мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора для очистки геномной ДНК GeneiPure Mammalian, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственного средства с ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro.[19]

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с помощью однофакторного ANOVA с LSD апостериорными тестами с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения того, были ли различия значимыми среди средних значений разных групп.Результаты выражали как среднее ± SE (стандартная ошибка). * P < 0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка Conium снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa образовывать колонии

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибель клеток происходила при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг/мл на A375, HepG2 и A549 соответственно при 48-часовой обработке [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат МТТ показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличилась через 48 часов, больше, чем через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa зависело от дозы, как и у других клеточных линий, которые мы использовали. При инкубации препарата в течение 24 часов процент жизнеспособности снижался до 36,48 ± 1 для дозы препарата 840 мкг/мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% происходило при дозе 722,6 ± 8,0 мкг/мл. За 48 ч инкубации препарата процент жизнеспособности клеток снижался до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг/мл, а 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при дозе 575,5 ± 5,0 мкг/мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и РВМС) показали, что кониум вызывал минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снижался до 85 ± 1,1 при обработке Conium 840 мкг/мл в течение 48 часов, а для PBMC процент жизнеспособности снижался при более высоких дозах и составлял 78,3 ± 2,4% при обработке Conium 840 мкг/мл. на 48 часов.

Результаты клоногенного анализа показали, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки кониумом (450 мкг/мл) колониеобразующая способность снижалась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти результаты позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний клеток HeLa [].

Обработка кониумом снижала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла

Обработка кониумом снижала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение кониумом не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ч ч пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 ч лечения [].

Признаки остановки клеточного цикла были обнаружены в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг/мл кониума) наблюдалось резкое увеличение клеточной популяции в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, что указывает на то, что индукция фрагментации ДНК устанавливалась через 24 и 48 ч [].

Обработка Conium инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Генерация АФК: это исследование, зависящее от времени, выявило накопление АФК при лечении препаратом (450 мкг/мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывало на накопление АФК.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию MMP. Исследования FACS показали, что пики смещены к оси Y по сравнению с контролем, подтверждая результаты микроскопического исследования

Обработка конием деполяризованных потенциалов митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения выявили снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация зависела от дозы, и максимальная деполяризация наблюдалась при лечении кониумом в дозе 450 мкг/мл [].

Обработка Conium вызывала морфологические изменения в клетках HeLa с фрагментацией нуклеосом

В клетках HeLa при обработке Conium наблюдались морфологические изменения с округлением цитоплазматической периферии с постепенным отрывом клеток от субстрата. Особенности включали вздутие клеточной мембраны и сморщивание клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдалась в окрашенных AO/EB клетках по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый свидетельствует об индукции апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], фрагментация была наибольшей при дозе Conium 450 мкг/мл.

Определение апоптоза: Клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг/мл Conium в течение 48 часов. ( а ) Морфологический анализ: результат показал вздутие клеточной мембраны и сморщивание клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO/EB: ядерная конденсация и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый свидетельствует об индукции апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальная степень фрагментации нуклеосом наблюдалась при дозе Conium 450 мкг/мл, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов после обработки. Точечный график свидетельствует о присутствии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [Вверху слева = мертвые клетки, внизу слева = живые клетки, вверху справа = клетки с поздним апоптозом и справа внизу = клетки с ранним апоптозом]. (e) Анализ фрагментации ДНК: Наличие фрагментации наблюдали в клетках, обработанных Conium, через 48 часов после обработки.Фрагментация была наибольшей при самой высокой дозе

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина в плазматической мембране с инициацией фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза было выполнено посредством оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V/PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг/мл). Клетки демонстрировали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на клеточную поверхность [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, получавшей Conium [].

Лечение Conium модулировало экспрессию различных белков, связанных с клеточной пролиферацией и апоптозом в клетках HeLa.

Лечение Conium повышало экспрессию определенных белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозах препарата 150, 300 и 450 мкг/мл соответственно. Экспрессия Bax повышалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе препарата, а активность TNF-α также усиливалась при лечении Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг/мл соответственно.Лечение кониумом усиливало расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при самой высокой дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 указывают на индукцию апоптоза в клетках, обработанных Conium [].

(a) Вестерн-блоттинг-анализ: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt подавлялась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась при обработке Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) Анализ ELISA: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции при лечении лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет экспрессирующую активность цитохрома с с точки зрения значений оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Экспрессия нативного Akt вместе с его активированной формой pAkt подавлялась обработкой конием.Отношения pAkt/Akt уменьшились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг/мл для обработки Conium соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также снижалась примерно на 23%, а экспрессия NFkB также снижалась примерно на 28% при обработке Conium в клетках HeLa [рис. 6]. GAPDH служил контролем нагрузки [].

Анализ ELISA на цитохром с показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Кониум-индуцированные спектральные изменения кругового дихроизма как в ct-ДНК, так и в ДНК HeLa клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В ct-ДНК, обработанной Conium, и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составляли 262 (+4) и 255 (0) соответственно, а для отрицательных полос составляли 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium, в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие препарата с ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (а) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения препарата решил провести дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что направленная на ДНК терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, предполагая, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум повышал активность АФК в первые часы в клетках HeLa.Это событие может проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в клетках, обработанных Conium. Обработка кониумом снижала жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени/дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением клеточной популяции в аннексин V-позитивном/PI-негативном квадранте, что подтверждает способность кониума индуцировать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 ч после обработки; одновременно скорость роста клеток снижалась с увеличением клеточной популяции в фазе суб-G1 после лечения кониумом, что еще раз подтверждает роль кониума в остановке клеточного деления, демонстрируя его ингибирующее рост действие на раковые клетки. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком, называемым pAkt/Akt.[23] Введение препарата снижало уровень pAkt/Akt и, предположительно, приводило к состоянию, которое приводило к уменьшению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, демонстрирующих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа МТТ также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы препарата, но такого состояния не наблюдалось в случае WRL-68 и РВМС. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO/EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV/PI. В наших выводах увеличение популяции клеток, находящихся в состоянии раннего апоптоза (о чем свидетельствуют клетки с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных группах, получавших лекарственное средство.Таким образом, были получены четкие доказательства того, что препарат может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после обработки.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать большую чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров опухолей, таких как p53.[13] Экспрессия p53 повышалась наряду с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. При остановке роста экспрессия Akt/pAkt, важной клеточной дифференцировки и пролиферативной молекулы [12], подавлялась.Одна из гипотез, объясняющая это событие, может заключаться в том, что после индукции лекарственного средства имели место перекрестные помехи p53-Akt.

Накопление АФК и деполяризация ММП являются одновременными процессами [24], приводящими к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз через внутренний путь [26]. В нашем исследовании при лечении препаратом происходила деполяризация ММП с увеличением цитозольного цитохрома с. Это может указывать на то, что раннее повышение АФК играет роль регуляторного механизма для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax регулируется белком-супрессором опухоли p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпел конформационный сдвиг, чтобы стать связанным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз.[26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и, таким образом, может нейтрализовать его проапоптотический эффект.Таким образом, изменение уровней Bax и Bcl-2, то есть соотношение Bcl-2/Bax, является решающим фактором, играющим важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток.[27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

АФК участвуют в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α является фактором или рецептором, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ.[28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижележащем уровне [29]. Наши результаты показали положительную регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 ниже по течению, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие препарата с ДНК и его способность индуцировать апоптоз посредством образования АФК

Резюме

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве народной медицины при раке шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по проверке его противоракового потенциала в отношении клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кониума вызывать цитотоксичность в различных нормальных и раковых клеточных линиях, включая тщательное исследование клеток HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кониума на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), митохондриальный мембранный потенциал (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Способность Conium повреждать ДНК и вызывать морфологические изменения также определяли под микроскопом. Экспрессию различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, критически изучали методами вестерн-блоттинга и ELISA. Если Conium может взаимодействовать непосредственно с ДНК, также было определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (CD).

Результаты:

Обработка Conium снижала жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и подавляла пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии sub-G.Обработка кониумом приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, усилению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный каспаза-3-зависимый путь. КД-спектроскопия показала, что Conium взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и поддерживают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарство-ДНК, пролиферация, активные формы кислорода Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N -метилкониин, конгидрин, псевдоконгидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на а. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого схожи с никотином. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами.[2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт уже давно используется в качестве традиционного средства от различных заболеваний.[4] Как, например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичка. В гомеопатии он используется как лекарство от рака молочной железы и рака шейки матки,[4] но его действие еще не подтверждено научно, за исключением сообщений о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы предполагаем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг/мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и РВМС и инкубировали в течение 48 часов. Далее в культуру HeLa вносили 70-840 мкг/мл препаратов на 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев для оценки процента жизнеспособности клеток [Значимость * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывало на снижение пролиферативной способности клеток HeLa при обработке кониумом в дозе 450 мкг/мл, а затем в контрольных планшетах через различные интервалы времени. Самая низкая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг/мл кониума) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии клеточного цикла M1=sub-G1 по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы терапия, нацеленная на ДНК, приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтезу белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-DNA), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Экстракты трав считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов.[7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами переносимости обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. АФК также деполяризуют митохондриальный мембранный потенциал (ММР) и индуцируют апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, нам стало интересно изучить, оказывает ли он какое-либо такое противораковое действие на клетки HeLa и может ли он продуцировать АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками.[12] Поэтому ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазы обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК.[14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, такой подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо было проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью индуцировать цитотоксичность в клетках HeLa, а также оказывает тормозящее действие на пролиферацию; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в ctDNA и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать ROS и деполяризовать MMP путем модулирования определенных клеточных сигнальных белков, связанных с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические препараты и реактивы

Модифицированная среда Игла Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотик пенициллин, стрептомицин, неомицин (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальную бычью сыворотку (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) получали от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для тканевых культур были приобретены у Tarson (Индия). Акридиновый оранжевый (АО) и бромистый этидий (ЭБ) были приобретены в SRL (Индия). 3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (MTT), йодид пропидия (PI), дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (H 2 DCFDA), 4×,6-диамидино-2- фенилиндола дигидрохлорид (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеинизотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) были собраны в Национальном центре клеточных исследований, Индия. Клетки содержали во влажном инкубаторе (ESCO, Сингапур) с кислородом окружающей среды и 5%-ным уровнем углекислого газа при 37°С. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% термоинактивированной FBS и 1% PSN.Клетки собирали с помощью 0,025% трипсина-ЭДТА в фосфатно-солевом буфере (PBS), высевали в чашках с требуемым количеством клеток и оставляли прикрепляться в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque по стандартной методике и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и РВМС распределяли в 96-луночные планшеты для микротитрования с плоским дном (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 3 клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг/мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37°С. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм в считывателе ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Было обнаружено, что из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium наиболее заметна и значительно выше в HeLa, чем в других линиях раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял выраженной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и РВМС. Поэтому клетки HeLa предпочитали другим раковым клеткам как наиболее подходящий материал для проведения всех других экспериментов, связанных с их вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результатов анализа МТТ были выбраны три разные дозы, а именно: D1 = 150 мкг/мл, D2 = 300 мкг/мл и D3 = 450 мкг/мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Положительный контроль (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разбавления), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал каких-либо ощутимых различий в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного лечения принимали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa исследовали на цитотоксическое действие Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарственных средств в течение 6 часов. Затем клетки промывали предварительно нагретым до 37°С PBS (фосфатно-солевой буфер), трипсинизировали и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток/лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом.[16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и трипсинизировали.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эта процедура повторялась для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторялись трижды. После анализа данных была получена гистограмма клеточной пролиферации.

Анализ клеточного цикла

Йодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг/мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление АФК определяли количественно после инкубации 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 ч соответственно с 450 мкг/мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальных мембран

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al. . ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37°С в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37°С в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина-123 оценивали методом проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США) и анализировали данные с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг/мл Conium соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. Через 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO/EB: Для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы препарата (150, 300 и 450 мкг/мл Conium). Через 48 ч обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и АО/ЭБ в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V/PI

Клетки обрабатывали 450 мкг/мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг/мл Conium соответственно) клетки HeLa промывали в PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг/мл) и протеиназа К (0,1 мг/мл)) в течение ночи, затем центрифугируют при 1200 g при 4°C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25:24:1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4°C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали 100% этанолом из водного слоя и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избыточных белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле, полосы визуализировали в УФ-светителе с последующим цифровым фотографированием.

Вестерн-блот-анализ

Клетки HeLa высевали в 75-мм планшеты (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 5 клеток на лунку. Клетки обрабатывали Conium в различных концентрациях (150, 300 и 450 мкг/мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) анализировали на 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на мембрану PVDF. После блокировки 3% БСА мембраны инкубировали отдельно со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4°C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. В качестве проявителя использовали BCIP-NBT, а количественную оценку белков проводили с помощью денситометрии с использованием программного обеспечения image J.[17]

Оценка активности цитохрома с с помощью непрямого ИФА

В этом эксперименте клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг/мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили в соответствии с протоколом производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома с измеряли с помощью считывателя ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность окраски измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил в этом анализе геном домашнего хозяйства.[18]

Взаимодействие препарата с ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были проведены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК клеток тимуса голого теленка (цтДНК) с концентрацией препарата 450 мкл/мл, используя необработанную цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия препарата с ДНК внутри клеток проводили инкубацию с конием в концентрации 450 мкл/мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора для очистки геномной ДНК GeneiPure Mammalian, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственного средства с ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro.[19]

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с помощью однофакторного ANOVA с LSD апостериорными тестами с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения того, были ли различия значимыми среди средних значений разных групп.Результаты выражали как среднее ± SE (стандартная ошибка). * P < 0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка Conium снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa образовывать колонии

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибель клеток происходила при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг/мл на A375, HepG2 и A549 соответственно при 48-часовой обработке [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат МТТ показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличилась через 48 часов, больше, чем через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa зависело от дозы, как и у других клеточных линий, которые мы использовали. При инкубации препарата в течение 24 часов процент жизнеспособности снижался до 36,48 ± 1 для дозы препарата 840 мкг/мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% происходило при дозе 722,6 ± 8,0 мкг/мл. За 48 ч инкубации препарата процент жизнеспособности клеток снижался до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг/мл, а 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при дозе 575,5 ± 5,0 мкг/мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и РВМС) показали, что кониум вызывал минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снижался до 85 ± 1,1 при обработке Conium 840 мкг/мл в течение 48 часов, а для PBMC процент жизнеспособности снижался при более высоких дозах и составлял 78,3 ± 2,4% при обработке Conium 840 мкг/мл. на 48 часов.

Результаты клоногенного анализа показали, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. Через 24 и 48 ч обработки кониумом (450 мкг/мл) колониеобразующая способность снижалась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти результаты позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний клеток HeLa [].

Обработка кониумом снижала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла

Обработка кониумом снижала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение кониумом не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ч ч пролиферация клеток постепенно снижалась, и самая низкая пролиферация была достигнута через 48 ч лечения [].

Признаки остановки клеточного цикла были обнаружены в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг/мл кониума) наблюдалось резкое увеличение клеточной популяции в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, что указывает на то, что индукция фрагментации ДНК устанавливалась через 24 и 48 ч [].

Обработка Conium инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Генерация АФК: это исследование, зависящее от времени, выявило накопление АФК при лечении препаратом (450 мкг/мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывало на накопление АФК.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию MMP. Исследования FACS показали, что пики смещены к оси Y по сравнению с контролем, подтверждая результаты микроскопического исследования

Обработка конием деполяризованных потенциалов митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения выявили снижение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация зависела от дозы, и максимальная деполяризация наблюдалась при лечении кониумом в дозе 450 мкг/мл [].

Обработка Conium вызывала морфологические изменения в клетках HeLa с фрагментацией нуклеосом

В клетках HeLa при обработке Conium наблюдались морфологические изменения с округлением цитоплазматической периферии с постепенным отрывом клеток от субстрата. Особенности включали вздутие клеточной мембраны и сморщивание клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдалась в окрашенных AO/EB клетках по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый свидетельствует об индукции апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], фрагментация была наибольшей при дозе Conium 450 мкг/мл.

Определение апоптоза: Клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг/мл Conium в течение 48 часов. ( а ) Морфологический анализ: результат показал вздутие клеточной мембраны и сморщивание клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO/EB: ядерная конденсация и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый свидетельствует об индукции апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальная степень фрагментации нуклеосом наблюдалась при дозе Conium 450 мкг/мл, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов после обработки. Точечный график свидетельствует о присутствии клеток с ранним апоптозом при обработке кониумом через 24 и 48 ч [Вверху слева = мертвые клетки, внизу слева = живые клетки, вверху справа = клетки с поздним апоптозом и справа внизу = клетки с ранним апоптозом]. (e) Анализ фрагментации ДНК: Наличие фрагментации наблюдали в клетках, обработанных Conium, через 48 часов после обработки.Фрагментация была наибольшей при самой высокой дозе

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина в плазматической мембране с инициацией фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза было выполнено посредством оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V/PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг/мл). Клетки демонстрировали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на клеточную поверхность [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, получавшей Conium [].

Лечение Conium модулировало экспрессию различных белков, связанных с клеточной пролиферацией и апоптозом в клетках HeLa.

Лечение Conium повышало экспрессию определенных белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозах препарата 150, 300 и 450 мкг/мл соответственно. Экспрессия Bax повышалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе препарата, а активность TNF-α также усиливалась при лечении Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг/мл соответственно.Лечение кониумом усиливало расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при самой высокой дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 указывают на индукцию апоптоза в клетках, обработанных Conium [].

(a) Вестерн-блоттинг-анализ: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt подавлялась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась при обработке Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) Анализ ELISA: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции при лечении лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет экспрессирующую активность цитохрома с с точки зрения значений оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Экспрессия нативного Akt вместе с его активированной формой pAkt подавлялась обработкой конием.Соотношение pAkt/Akt уменьшилось и составило 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг/мл для обработки Conium соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также снижалась примерно на 23%, а экспрессия NFkB также снижалась примерно на 28% при обработке Conium в клетках HeLa [рис. 6]. GAPDH служил контролем нагрузки [].

Анализ ELISA на цитохром с показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Кониум-индуцированные спектральные изменения кругового дихроизма как в ct-ДНК, так и в ДНК HeLa клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В ct-ДНК, обработанной Conium, и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составляли 262 (+4) и 255 (0) соответственно, а для отрицательных полос составляли 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium, в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие препарата с ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (а) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения препарата решил провести дальнейшие исследования клеток HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что направленная на ДНК терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, предполагая, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум повышал активность АФК в первые часы в клетках HeLa.Это событие может проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в клетках, обработанных Conium. Обработка кониумом снижала жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени/дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением клеточной популяции в аннексин V-позитивном/PI-негативном квадранте, что подтверждает способность кониума индуцировать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 ч после обработки; одновременно скорость роста клеток снижалась с увеличением клеточной популяции в фазе суб-G1 после лечения кониумом, что еще раз подтверждает роль кониума в остановке клеточного деления, демонстрируя его ингибирующее рост действие на раковые клетки. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком, называемым pAkt/Akt.[23] Введение препарата снижало уровень pAkt/Akt и, предположительно, приводило к состоянию, которое приводило к уменьшению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, демонстрирующих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа МТТ также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы препарата, но такого состояния не наблюдалось в случае WRL-68 и РВМС. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO/EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV/PI. В наших выводах увеличение популяции клеток, находящихся в состоянии раннего апоптоза (о чем свидетельствуют клетки с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных группах, получавших лекарственное средство.Таким образом, были получены четкие доказательства того, что препарат может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после обработки.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать большую чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров опухолей, таких как p53.[13] Экспрессия p53 повышалась наряду с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. При остановке роста экспрессия Akt/pAkt, важной клеточной дифференцировки и пролиферативной молекулы [12], подавлялась.Одна из гипотез, объясняющая это событие, может заключаться в том, что после индукции лекарственного средства имели место перекрестные помехи p53-Akt.

Накопление АФК и деполяризация ММП являются одновременными процессами [24], приводящими к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз через внутренний путь [26]. В нашем исследовании при лечении препаратом происходила деполяризация ММП с увеличением цитозольного цитохрома с. Это может указывать на то, что раннее повышение АФК играет роль регуляторного механизма для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax регулируется белком-супрессором опухоли p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпел конформационный сдвиг, чтобы стать связанным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз.[26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и, таким образом, может нейтрализовать его проапоптотический эффект.Таким образом, изменение уровней Bax и Bcl-2, то есть соотношение Bcl-2/Bax, является решающим фактором, играющим важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток.[27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

АФК участвуют в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α является фактором или рецептором, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ.[28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижележащем уровне [29]. Наши результаты показали положительную регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 ниже по течению, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Гомеопатия при артериальном давлении

Что такое кровяное давление?

По сути, кровяное давление относится к давлению, создаваемому, когда сердце выкачивает кровь, что необходимо для обеспечения того, чтобы кровь правильно достигала всех частей и тканей тела.

Артериальное давление человека измеряется с помощью прибора, известного как сфигмоманометр, и оптимальное артериальное давление человека составляет 120/80 (систолическое и диастолическое артериальное давление). Высокие или низкие колебания нормального кровяного давления могут вызвать проблемы со здоровьем, иногда даже опасные для жизни состояния.

Высокое кровяное давление, низкое кровяное давление и показания артериального давления

Высокое кровяное давление сегодня затрагивает миллионы людей во всем мире и в настоящее время является одним из наиболее серьезных заболеваний.Высокое кровяное давление, также известное как гипертония, представляет собой расстройство, при котором кровяное давление превышает нормальные пределы. Когда кровяное давление человека измеряется и обнаруживается, что оно превышает показания 140/90, говорят, что человек страдает от высокого кровяного давления.



И наоборот, когда показания артериального давления человека падают ниже 110/70, считается, что человек страдает от гипотонии или низкого кровяного давления.

Причины артериального давления

Колебания артериального давления могут возникать по разным причинам.Обычно чрезмерное потребление безрецептурных препаратов, кортикостероидов и иммунодепрессантов, особенно при длительном приеме, может вызвать гипертонию.


Использование нестероидных противовоспалительных препаратов, ингибиторов и т. д. также может вызвать повышение артериального давления и повлиять на почки. Употребление табака и табачных изделий, а также употребление алкоголя также могут повышать артериальное давление. Также считается, что высокое кровяное давление, вызванное алкоголем, чаще встречается у женщин, и потребление кофеина и продуктов, содержащих кофеин, также может играть роль в повышении кровяного давления.
Напротив, низкое кровяное давление обычно возникает у людей, которые не подходят, слишком слабы и хрупки. Беременные женщины тоже склонны страдать от низкого кровяного давления. Некоторые другие проблемы, включая эндокринные расстройства, проблемы с сердцем, такие как брадикардия, сердечный приступ, сердечная недостаточность, обезвоживание, усталость, слабость и потеря крови, могут быть связаны с низким кровяным давлением.
Использование некоторых лекарств, таких как альфа-блокаторы, диуретики, бета-блокаторы и т. д., также может вызвать падение артериального давления. Также известно, что аллергические реакции и инфекции в организме, недостаток необходимых питательных веществ и прием антидепрессантов в течение длительного периода времени вызывают низкое кровяное давление у людей.

Симптомы и признаки артериального давления

Большинство людей, страдающих повышенным или пониженным артериальным давлением, не замечают никаких признаков или симптомов, а даже если и обнаруживают, то обычно игнорируют их.

Чаще всего люди с гипертонией могут испытывать приступы головокружения, головной боли и более склонны к носовым кровотечениям.


С другой стороны, люди, страдающие низким кровяным давлением, могут испытывать обмороки, усталость, депрессию, головокружение, потерю концентрации, тошноту, жажду и нечеткость зрения.

Гомеопатия при артериальном давлении

Для пациентов, страдающих от высокого кровяного давления, гомеопатическое лечение может быть очень полезным, особенно если болезнь не очень давняя. Здесь мы перечислили некоторые распространенные гомеопатические лекарства, которые можно использовать для борьбы с высоким и низким кровяным давлением.

Гомеопатические лекарства от высокого кровяного давления:

Белладона: Белладона известна своей эффективностью при лечении высокого кровяного давления и показывает значительное улучшение у людей с учащенным пульсом, расширенными зрачками и покрасневшим лицом.


Aconitum: Aconitum является полезным гомеопатическим средством, особенно для пациентов, которые страдают от высокого кровяного давления, которое возникает внезапно, и когда пациент постоянно сталкивается со страхом смерти.
Nux Vomica: Nux Vomica эффективно снижает высокое кровяное давление, возникающее из-за переедания.

Lycopodium: Lycopodium также является эффективным гомеопатическим средством общего действия для пациентов, страдающих от высокого кровяного давления.

Ignatia: Высокое кровяное давление, возникающее из-за эмоционального расстройства, гнева, горя и т. д., можно эффективно лечить с помощью Ignatia.

Lachesis: Lachesis – это гомеопатическое средство, которое особенно эффективно при лечении высокого кровяного давления, возникающего во время менопаузы.

Гомеопатические лекарства от низкого кровяного давления:

Кониум: Кониум — это гомеопатическое лекарство, которое особенно помогает пожилым пациентам, страдающим от низкого кровяного давления, чей организм ослаб и органы не функционируют на оптимальном уровне. .


Наперстянка: Это эффективное гомеопатическое средство для пациентов, страдающих от проблем с сердцем, нерегулярного и очень медленного пульса, одышки и усталости.

Calcarea phos: Calcarea phos — эффективное гомеопатическое средство для лечения слабых, усталых и истощенных людей.

Kalmia: Kalmia может оказаться хорошим гомеопатическим средством для пациентов, страдающих низким кровяным давлением.


Профилактика артериального давления

Употребление натуральных продуктов и здоровый образ жизни — лучший и самый простой способ контролировать артериальное давление как для пациентов, страдающих гипертонией, так и для пациентов с гипотонией. Ожирение и недостаток физической активности являются основными причинами высокого кровяного давления; вот почему похудение и регулярные физические упражнения могут помочь вам контролировать кровяное давление.


Сокращение содержания натрия и употребление в пищу более натуральных органических продуктов может стать еще одним эффективным способом контроля артериального давления. Сокращение потребления алкоголя и никотина также может помочь пациентам естественным образом снизить уровень артериального давления.

Самые популярные в Мединдии:

Как гомеопатия может помочь в лечении диабета

Диабет — это пожизненное состояние, при котором уровень глюкозы в крови, также известный как сахар в крови, становится слишком высоким.Это состояние может затронуть любого человека и не имеет возрастных ограничений. Случаи диабета резко увеличились в недавнем прошлом, и, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ожидается, что их число будет расти и дальше. Для человека, страдающего диабетом, простой прием лекарств не помогает контролировать уровень сахара в крови. Им необходимо внести некоторые позитивные изменения в свой образ жизни для достижения лучших результатов. Большинство людей, страдающих этим заболеванием, часто выбирают аллопатические лекарства, но гомеопатия может быть весьма полезной при лечении диабета.Давайте посмотрим, как гомеопатия может помочь вылечиться от этого состояния.

Гомеопатия и диабет:
Гомеопатия – альтернативная медицинская практика. Основной задачей гомеопатии при лечении диабетика является улучшение общего состояния здоровья человека. Это связано с тем, что диабет не только ограничен кровотоком, но также влияет на различные части тела и органы. Общие симптомы человека, страдающего от проблемы диабета, следующие:


-голод
-усталость -чрезмерная жажда
-чрезмерное мочеиспускание
-сухость во рту
— кожные язвы
-затуманенное зрение

Гомеопатия в основном использует натуральные вещества для лечения симптомов диабета.Он основан на принципе «подобное лечится подобным». Итак, гомеопатические лекарства изготавливаются из минералов, растений или животных.

Гомеопат из Дели, доктор Хиту Кера, пояснил, что гомеопатия не лечит диабет, она может только помочь контролировать его.

«Диабет — это нарушение обмена веществ и образа жизни. До тех пор, пока диетическое вмешательство и физические упражнения не будут включены в распорядок дня, никакие лекарства не смогут контролировать это состояние», — объяснил доктор Кера.

Далее она добавила, что для лечения диабета в гомеопатии конституциональные лекарства предоставляются после анализа симптомов всего организма.«Конституциональные лекарства назначаются с учетом общего состояния здоровья человека. Как только общее состояние здоровья улучшается, уровень инсулина остается под контролем».

Некоторые из распространенных средств для лечения гомеопатии:

-Syzygium jambolanum или черная слива: используется в гомеопатии для лечения чрезмерной жажды, слабости, кожных язв и чрезмерного мочеиспускания.
-Uranium nitricum: используется для лечения чрезмерного мочеиспускания и тошноты.
— Conium (болиголов): это травянистое цветущее растение используется для лечения онемения в ногах и руках.
— Календула (календула): это ароматическое растение, а его цветы используются для изготовления лекарств. Добавки, изготовленные из этого растения, используются для лечения инфицированных язв.

Насколько эффективна гомеопатия при лечении диабета:
Хотя гомеопатия использует натуральные ингредиенты для лечения любого заболевания, все же имеется мало доказательств того, что она полезна при лечении диабета.

Применение Syzgium jambolanum на мышах и крысах не показало никаких преимуществ. Другие гомеопатические лекарства для лечения диабета еще не проходили клинические испытания на людях. Исследование, проведенное Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям в Австралии в 2015 году, не продемонстрировало убедительных доказательств того, что гомеопатия эффективна при лечении любых заболеваний.



Даже доктор Кера ясно дал понять, что гомеопатия может быть отличной дополнительной терапией при лечении диабета и хорошо помогает при лечении побочных эффектов диабета.«Гомеопатия — отличная дополнительная терапия. Она весьма эффективна при побочных эффектах диабета, таких как невропатия, эректильная дисфункция. Это не основная терапия».

Говоря о побочных эффектах лекарств при приеме с аллопатией, она сказала, что, поскольку оба метода лечения действуют на разные причины (аллопатия для контроля диабета и гомеопатия для контроля побочных эффектов), они не имеют никакого противодействия.

Суть
Поскольку гомеопатические лекарства в основном изготавливаются из натуральных веществ, побочные эффекты очень редки.Существует лишь небольшой риск возникновения аллергической реакции при использовании гомеопатических препаратов. Иногда люди прекращают прием аллопатических лекарств, чтобы посмотреть, работает ли их гомеопатия, что может привести к серьезным осложнениям. Итак, если вы хотите попробовать гомеопатию, не оставляйте лекарства, прописанные врачом.

Отказ от ответственности : Взгляды и мнения, высказанные врачами, являются их независимым профессиональным суждением, и мы не несем никакой ответственности за точность их взглядов.Это не должно рассматриваться как замена консультации врача. Пожалуйста, проконсультируйтесь с вашим лечащим врачом для получения более подробной информации.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.