Энтеровирусная инфекция что это: Страница не найдена | Муниципальное бюджетное учреждение здравоохранения «Городская больница №8 г. Ростова-на-Дону»

Содержание

Что такое энтеровирусная инфекция

Энтеровирусная инфекция – инфекционное заболевание, вызываемое определенным видом вируса.

Энтеровирус входит в группу кишечных вирусов. Имеет много разновидностей (серотипов). Они способны поражать многие ткани и органы человека (центральная нервная система, сердце, легкие, печень, почки и др.) и это определяет значительное клиническое многообразие вызываемых ими заболеваний.

Заболевание носит сезонный характер, вспышки возникают в весенне-летний и летне-осенний периоды. Заражение происходит через воду, продукты питания, а также испражнения больного, через мельчайшие капельки слюны и мокроты при кашле и чихании. Очень часто заражение происходит при купании в открытых водоемах.

Энтеровирусы устойчивы во внешней среде: хорошо переносят низкие температуры (в условиях холодильника они сохраняются в течение нескольких недель.Вирус быстро погибает при прогревании, кипячении, при воздействии хлорсодержащих препаратов, ультрафиолетового облучения.

Как проявляется инфекция?

Заболевание начинается с повышения температуры до 38-40º, слабости, головной боли, тошноты, рвоты, светобоязни. Эти симптомы могут сопровождаться болями в области сердца, живота, мышцах, боли в горле, герпетическими высыпаниями на дужках и миндалинах. В некоторых случаях наблюдаются катаральные явления со стороны верхних дыхательных путей, насморк, кашель. На 1-2 день болезни появляется сыпь, преимущественно на руках, ногах, вокруг и в полости рта, которые держатся в течение 24-48 часов (иногда до 8 дней) и затем бесследно исчезают.

Иногда могут развиваться острые вялые параличи конечностей, судороги, дрожание конечностей, косоглазие, нарушение глотания, речи и др.

Как себя защитить?

Меры неспецифической профилактики энтеровирусной инфекции такие же, как при любой острой кишечной инфекции – необходимо соблюдать следующие правила:

  • Для питья использовать только кипяченую воду или бутилированную;
  • Мыть руки с мылом перед каждым приемом пищи и после каждого посещения туалета, строго соблюдать правила личной и общественной гигиены;
  • Перед употреблением фруктов и овощей их необходимо тщательно мыть с применением щетки и последующим ополаскиванием кипятком;
  • Не приобретать продукты у частных лиц и в неустановленных для торговли местах;
  • Соблюдать правила личной гигиены.

При контакте с больным энтеровирусной инфекцией необходимо наблюдать за состоянием своего здоровья и при появлении каких-либо жалоб немедленно обратиться к врачу! Помните, что заболевание легче предупредить, соблюдая элементарные меры профилактики, чем лечить!

Осторожно! Энтеровирусная инфекция! | Официальный сайт города Липецка

Уважаемые жители!

Управление Правобережным округом администрации города Липецка напоминает об опасности энтеровирусной инфекции!

Что такое энтеровирусная инфекция?

Энтеровирусная инфекция – инфекционное заболевание, вызываемое определенным видом вируса. Энтеровирус входит в группу кишечных вирусов. Имеет много разновидностей (серотипов). Они способны поражать многие ткани и органы человека (центральная нервная система, сердце, легкие, печень, почки и др.) и это определяет значительное клиническое многообразие вызываемых ими заболеваний.

Заболевание носит сезонный характер, вспышки возникают в весеннее — летний и летнее — осенний периоды. Заражение происходит через воду, продукты питания, а также испражнения больного, через мельчайшие капельки слюны и мокроты при кашле и чихании. Очень часто заражение происходит при купании в открытых водоемах.

Энтеровирусы устойчивы во внешней среде: хорошо переносят низкие температуры (в условиях холодильника они сохраняются в течение нескольких недель), в водопроводной воде выживают до 18 дней, в речной воде – около месяца, в очищенных сточных водах – до двух месяцев, а также на предметах обихода, продуктах питания (молоко, фрукты, овощи). Вирус быстро погибает при прогревании, кипячении, при воздействии хлорсодержащих препаратов, ультрафиолетового облучения.

Как проявляется инфекция?

Вирус поражает все органы и ткани, но, в основном, страдает нервная ткань, сердце, печень, поджелудочная железа, мышечная ткань, глаза. Заражаться может каждый, но чаще болеют дети.

Заболевание начинается с повышения температуры до 38-40˚ С, слабости, головной боли, тошноты, рвоты, светобоязни.

Эти симптомы могут сопровождаться болями в области сердца, живота, мышцах, боли в горле, герпетическими высыпаниями на дужках и миндалинах. В некоторых случаях наблюдаются катаральные явления со стороны верхних дыхательных путей, насморк, кашель. На 1-2 день болезни появляется сыпь, преимущественно на руках, ногах, вокруг и в полости рта, которые держатся в течение 24-48 часов (иногда до 8 дней) и затем бесследно исчезают.

Иногда могут развиться острые вялые параличи конечностей, судороги, дрожание конечностей, косоглазие, нарушение глотания, речи и др.

Что делать, если заболел?

В случае появления этих жалоб необходимо немедленно обратиться к врачу, не ждать, надеясь, что все пройдет, не пытаться самостоятельно лечиться. Необходимо срочно поместить больного в стационар, т.

к. он может быть источником заражения людей, проживающих рядом.

Как себя защитить?

Меры неспецифической профилактики энтеровирусной инфекции такие же, как при любой острой кишечной инфекции необходимо соблюдать следующие правила:

• Для питья использовать только кипяченую или бутилированную воду.

• Мыть руки с мылом перед каждым приемом пищи и после каждого посещения туалета, строго соблюдать правила

личной и общественной гигиены.

• Перед употреблением фруктов и овощей их необходимо тщательно мыть с применением щетки и последующим

ополаскиванием кипятком.

• Купаться только в официально разрешенных местах, при купании стараться не заглатывать воду.

• Не приобретать продукты у частных лиц и в неустановленных для торговли местах.

• Соблюдать правила личной гигиены.

При контакте с больным энтеровирусной инфекцией необходимо наблюдать за состоянием своего здоровья и проявлении каких-либо жалоб немедленно обратиться к врачу!

 

Что такое Энтеровирусная инфекция ?

 

Энтеровирусная инфекция — это группа острых инфекционных болезней, вызываемые кишечными вирусами (энтеровирусами), характеризующихся лихорадкой и полиморфизмом клинических симптомов, обусловленных поражением ЦНС, сердечно-сосудистой системы, ЖКТ, мышечной системы, легких, печени, почек и др.

органов. 

В последние годы наметилась четкая тенденция активизации энтеровирусной инфекции в мире, о чем свидетельствуют постоянно регистрируемые в разных странах эпидемиологические подъемы заболеваемости и вспышки. География энтеровирусных инфекций чрезвычайно широка и охватывает все страны мира, в том числе и постсоветского пространства. Так, в научной литературе описаны вспышки энтеровирусного (асептического) менингита во Франции (2002 г., 559 случаев), в Японии (2000 г., заболело несколько сотен человек, были смертельные исходы, энтеровирус 71-го типа), США (2001 г., более 100 заболевших, вирус ECHO 13), Испании (2000 г., 135 случаев, вирус ECHO 13), Германии (2001 г., заболело 70 человек, вирус Коксаки В5), Турции. Наиболее крупные из описанных вспышек отмечались на Тайване (1998, 2000 гг., заболело около 3 тысяч человек) и в Сингапуре (2000 г., 1 тысяча случаев, 4 смертельных исхода, ), Тунисе (2003 г., 86 человек, представлена вирусами ECHO 6, 13). На постсоветском пространстве наиболее крупные вспышки в последние годы наблюдались в России, в Приморском крае (Хабаровск, 1997 г.

, преобладали вирусы Коксаки В3, 4, 5, EСНО 6, 17, энтеровирус 70-го типа) и в Калмыкии (2002 г., 507 случаев, вирус ECHO 30), а также в Украине (1998 г., заболело 294 человека, вирус Коксаки В4). 

Одной из основных особенностей этих инфекций является здоровое вирусоносительство, постоянно обусловливающее возникновение спорадических форм и массовых заболеваний, которое, как и заболеваемость, наблюдается не только среди детей младшего и старшего возраста, но и среди взрослых. Установлено, что продолжительность пребывания энтеровирусов в кишечнике не превышает 5 месяцев. 

Однако основное значение в поддержании циркуляции энтеровирусов среди населения, по-видимому, имеют два фактора — наличие восприимчивых контингентов и значительная длительность вирусоносительства. Последняя особенность позволяет вирусу после инфицирования неиммунных лиц, создавая высокоиммунную прослойку, дождаться новых восприимчивых контингентов. 

 

Патогенез (что происходит?) во время Энтеровирусной инфекции:

Энтеровирусные инфекции относятся к группе антропонозов. Существование энтровирусов в природе обусловлено наличием двух основных резервуаров — человека, у которого происходит размножение и накопление вируса, и внешней среды (вода, почва, пищевые продукты), в которой они способны выживать благодаря высокой устойчивости. Риск возникновения вспышек значительно возрастает при «вбросе» в человеческую популяцию массивного энтеровирусного загрязнения, что чаще всего может быть реализовано через водный и пищевой путь передачи. 

Описывается вертикальный путь передачи энтеровирусных инфекций. Высокий риск врожденной энтеровирусной инфекции, как правило, определяется не острым энтеровирусным заболеванием, перенесенным матерью во время беременности, а наличием у женщины персистентной формы энтеровирусной инфекции. С врожденной энтеровирусной инфекцией связывают синдром внезапной детской смерти. 

Источник инфекции — больной человек или вирусоноситель. Механизм передачи — воздушно-капельный или фекально-оральный. Чаще болеют дети и молодые люди. Характерна летне-осенняя сезонность. Иммунитет после перенесенного заболевания достаточно продолжительный (до нескольких лет). 

Входные ворота инфекции – слизистые оболочки верхних дыхательных путей или пищеварительного тракта, где вирус размножается, накапливается и вызывает местную воспалительную реакцию, что проявляется симптомами герпетической ангины, ОРЗ, фарингита или кишечной дисфункцией. В результате последующей вирусемии вирусы гематогенно разносятся по всему организму и оседают в различных органах и тканях. 


Большинство случаев энтеровирусных инфекций протекает бессимптомно. Большая часть клинически заметных проявлений — простудоподобные заболевания, причем энтеровирусы считаются вторым по частоте возбудителем ОРВИ. 

Условно можно выделить две группы заболеваний, вызываемых энтеровирусами: 
I. Потенциально тяжелые: 
— серозный менингит; 
— энцефалит; 
— острый паралич; 
— неонатальные септикоподобные заболевания; 
— мио-(пери-)кардит; 
— гепатит; 
— хронические инфекции иммунодефицитных лиц.  

II. Менее опасные: 
— трехдневная лихорадка с сыпью или без; 
— герпангина; 
— плевродиния; 
— везикулярный фарингит; 
— конъюнктивит; 
— увеит; 
— гастроэнтерит. 

Диагностика Энтеровирусной инфекции:

Диагностика энтеровирусной инфекции включает 4 основных метода: 
1) серологический; 
2) иммуногистохимический; 
3) молекулярно-биологический; 
4) культуральный. 

Основной целью иммуногистохимических методов является обнаружение in situ энтеровирусных антигенов. К числу наиболее доступных методов иммуногистохимии относятся иммунофлюоресцентный и иммунопероксидазный анализы. 

энтеровирусами. При использовании плеконарила в лечении менингитов у детей достоверно отмечено сокращение менингеальных симптомов на 2 дня. 

Профилактика Энтеровирусной инфекции:

Специфическая профилактика. Не разработана. 

Неспецифическая профилактика. В очаге инфекции контактным детям можно закапывать лейкоцитарный интерферон по 5 капс. в носовые ходы 3–4 раза в день в течение 7 дней. Защитное действие оказывает иммуноглобулин в дозе 0,2 мл/кг, в/м. 
Проветривание и дезинфекция помещений, соблюдение правил удаления и обеззараживания нечистот, обеспечение населения безопасными в эпидемиологическом плане продуктами. 

Врач – инфекционист Бардаханова Г.В

Общие сведения об энтеровирусных инфекциях — инфекционные заболевания

Здоровые взрослые могут быть инфицированы, но у них, как правило, мало симптомов или они отсутствуют вовсе. Взрослые с ослабленным иммунитетом могут иметь тяжелые респираторные заболевания.

Каждый год респираторные инфекции, вызванные EV-D68, выявляются у нескольких детей, а небольшие вспышки имеют тенденцию возникать раз в два года. Однако в конце лета и осенью 2014 г. было подтверждено более 1000 случаев крупной вспышки в США. У значительного числа детей развился тяжелый респираторный дистресс, несколько детей умерли. В то же время сообщалось о группах случаев у детей с очаговой слабостью или параличом конечностей с поражением спинного мозга (видимым на МРТ), соответствующим острому вялому миелиту после респираторного заболевания; EV-D68 был идентифицирован в образцах из дыхательных путей в двух третях случаев в двух отдельных кластерах вспышек и в крови одного ребенка во время прогрессирования паралича. Секвенированные вирусы были почти идентичны и имели гомологию с полиовирусом и энтеровирусом D70, которые, как известно, связаны с острым вялым миелитом и подтверждают потенциальную причинную роль EV-D68 в развитии острого вялого миелита (2 Общие ссылки Энтеровирусы, наряду с риновирусами (см. Простуда) и пареховирусы человека относятся к роду пикорнавирусов ( pico , или малых РНК-вирусов).Все энтеровирусы антигенно гетерогенны… читать далее ). Продолжающееся наблюдение Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) выявило 120 случаев острого вялого миелита осенью 2014 г., что совпало со вспышкой EV-D68 (3 Общие ссылки Энтеровирусы, а также риновирусы (см. Простуда) и пареховирусы человека , относятся к роду пикорнавирусов ( pico , или малые РНК-содержащие вирусы). Все энтеровирусы антигенно гетерогенны… читать далее).После отсутствия зарегистрированных случаев EV-D68 и только 22 спорадических случаев острого вялого миелита, зарегистрированных в 2015 г., в 2016 г. произошел еще один рост острого вялого миелита: 153 случая были зарегистрированы в США во время пика активности EV-D68 (см. CDC: Случаи AFM). и вспышки).

Еще одна крупная вспышка респираторного заболевания, связанного с EV-D68, достигла пика в США в сентябре 2018 года. Активный эпиднадзор CDC выявил вирус у 13,9% педиатрических пациентов с острыми респираторными заболеваниями в нескольких крупных медицинских центрах США по сравнению с 0.08% аналогичных пациентов в 2017 году. Две трети пациентов с EV-D68 нуждались в госпитализации, что подчеркивает тяжесть заболевания. Также одновременно наблюдалось увеличение числа зарегистрированных случаев острого вялого миелита: в 2018 г. было зарегистрировано более 200 случаев, подтвержденных CDC, по сравнению с 38 случаями в 2017 г., что еще раз подтверждает связь между инфекцией EV-D68 и острым вялым миелитом (4 Общие ссылки Энтеровирусы, наряду с риновирусы (см. Простуда) и пареховирусы человека относятся к роду пикорнавирусов ( pico , или малые РНК-вирусы).Все энтеровирусы антигенно гетерогенны… читать далее ). В целом, эти эпидемиологические связи вместе с данными на животных моделях убедительно свидетельствуют о причинно-следственной связи между инфекцией EV-D68 и острым вялым миелитом (5 Общие ссылки). , или малые, РНК-содержащие вирусы. Все энтеровирусы антигенно гетерогенны… подробнее ).

EV-D68 следует рассматривать как этиологию необъяснимой тяжелой респираторной инфекции, особенно если она связана с группой случаев в конце лета и осенью.Рекомендуется специальное тестирование при потенциальных вспышках, которое может быть организовано через должностных лиц общественного здравоохранения.

Клинические характеристики тяжелой неонатальной энтеровирусной инфекции: систематический обзор | BMC Pediatrics

В результате поиска в базе данных было выявлено 1647 исследований, 243 из них были сохранены после проверки заголовков и рефератов. Впоследствии 177 исследований были исключены из полнотекстового обзора. Наконец, в анализ были включены 66 статей с 237 случаями тяжелой неонатальной энтеровирусной инфекции.На рисунке 1 показана блок-схема процесса выбора исследования. Таблицы s1, s2 и s3 в дополнительном материале показывают общие характеристики включенных новорожденных и оценку риска систематической ошибки. Клиническая характеристика новорожденных с тяжелой энтеровирусной инфекцией по основным осложнениям представлена ​​в таблице 1.

Рис. 1

Диаграмма потока исследований отбор

Таблица 1 Клинические особенности новорожденных с тяжелыми энтеровирусными инфекциями (%)

Всего у 237 новорожденных развились тяжелые осложнения энтеровирусной инфекции, соотношение мальчиков и девочек 116/88 и массой тела при рождении от 1730 до 4500 г. В целом 51,3% (101/197) недоношенных детей и 52,5% (95/181) новорожденных были родоразрешены путем кесарева сечения. В 70,5% (167 случаев) случаев возраст появления симптомов был менее 7 дней. Семьдесят случаев (29,5%) были связаны с заболеванием матери до родов, а в 16 случаях (6,8%) сообщалось о наличии симптомов у братьев, сестер или друзей. Культура околоплодных вод матери выявила дефицит Staphylococcus epidermidis при миокардите [7]. Также у матери был диагностирован хориоамнионит [8], а у другой матери заподозрен амнионит [9].Энтеровирус был идентифицирован в основном из ректальных образцов или образцов кала (118, 49,8%), а затем из респираторных образцов (101, 42,6%). Кроме того, 82,7% (124 случая) новорожденных имели коксакивирусную инфекцию B (CVB), 16,7% (25 случаев) — эховирусную инфекцию и 0,7% (1 случай) — энтеровирусную инфекцию 71 (EV71). Клинические проявления включали температурные нарушения (127, 53,6%), сыпь (88, 37,1%), плохой аппетит (58, 24,5%), респираторные симптомы (45, 19,0%), вялость (40, 16,9%), желтуху (38). , 16.0%), недостаточность кровообращения или шок (37, 15,6%), аритмии (29, 12,2%), тромбоцитопения (28, 11,8%), плохая перфузия (23, 9,7%), раздражительность (17, 7,2%), гипотония ( 9, 3,8%) и диарея (9, 3,8%). В общей сложности 127 (53,6%) новорожденных лечили эмпирическими антибиотиками и 97 (40,9%) новорожденных — внутривенным иммуноглобулином (ВВИГ). Противовирусные препараты включали покапавир (3, 1,3%) и плеконарил (14, 5,9%). В целом летальность составила 30,4% (72 случая).

Всего было включено 109 случаев гепатита или коагулопатии из 17 исследований [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24] ( 57 мальчиков, 46 девочек).Заболевания матери в период от 2  месяцев до родов до 1 недели после родов были отмечены в 33 случаях (30,3%), в том числе лихорадка — в 23, боли в животе — в шести, гриппоподобный синдром — в пяти, диарея — в четырех случаях. В трех случаях у братьев и сестер были симптомы лихорадки и боли в горле за несколько дней до родов. Новорожденные с первыми симптомами в период между днем ​​рождения и 1  месяцем; 98 (89,9%) поступили в течение 7 дней после рождения. Было извлечено 87 записей серотипов энтеровирусов, включающих 16 случаев эховирусной инфекции (эховирус 3 в одном, эховирус 21 в одном, эховирус 11 в четырех, эховирус 30 в двух, эховирус 7 в двух, эховирус 6 в двух, эховирус 5 в один) и 71 случай CVB (CVB1 у 22, CVB2 у одного, CVB3 у 46, CVB4 у одного, CVB5 у одного).Наиболее частым симптомом были температурные аномалии: 60 случаев нестабильности температуры, 17 случаев лихорадки и 5 случаев гипотермии. Другими симптомами были сыпь (73, 67,0%), желтуха (32, 29,4%) и асцит (27, 24,8%). Осложнения, связанные с гепатитом, составили 23 случая миокардита, 1 случай гипертрофической кардиомиопатии, 5 случаев внутричерепных кровоизлияний, 5 случаев энцефалита, 8 случаев диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром), 3 случая почечной недостаточности, 3 случая пневмонита.Повышение уровня аспартатаминотрансферазы (АСТ) или аланинтрансаминазы (АЛТ) было зарегистрировано в 85 случаях. В общей сложности 95 (87,2%) новорожденных лечились антибиотиками и 56 (51,4%) — ВВИГ. Используемые противовирусные препараты: покапавир (1, 0,9%) и плеконарил (9, 8,3%). Кроме того, 94 (86,2%) новорожденным потребовалось переливание компонентов крови, таких как свежезамороженная плазма, тромбоциты, концентрат эритроцитов. Другое систематическое поддерживающее лечение включало искусственную вентиляцию легких (17, 15.6%), перитонеальный диализ (4, 3,7%), гемодиализ (1, 0,9%), обменное переливание крови (4, 3,7%), постоянная вено-венозная гемофильтрация (1, 0,9%). Троим (2,8%) новорожденным проведена трансплантация печени. Двадцать девять из 109 (26,6%) новорожденных умерли в возрасте от 8 дней до 2 месяцев.

Всего 88 новорожденных в 31 исследовании [7, 9, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 ,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53] развилось основное осложнение миокардита с соотношением мужчин/женщин 42/29.В общей сложности 54,7% (35/64) новорожденных были младше 7 дней на момент появления симптомов. У двадцати новорожденных в анамнезе было заболевание матери до родов, а в восьми случаях сообщалось о братьях, сестрах или друзьях с симптомами. У 39 новорожденных была инфекция CVB (CVB1 у 13, CVB2 у 2, CVB3 у 13, CVB4 у 5, CVB5 у 3 и CVB2 у 1). У одного новорожденного была инфекция эховируса 6. Клинические признаки температурных нарушений (8 новорожденных с гипотермией, 15 с лихорадкой и 1 с нестабильностью температуры) наблюдались у 24 новорожденных.Признаки миокардита включали респираторные симптомы (24, 27,3%), аритмии (27, 30,7%), недостаточность кровообращения или шок (35, 39,8%), нарушение перфузии (11, 12,5%). Сообщалось, что миокардит сопровождался другими осложнениями, включая менингоэнцефалит (10 случаев), почечную недостаточность (3 случая), ДВС-синдром (6 случаев) и гепатит (7 случаев). Повышение уровня тропонина и мозгового натрийуретического пептида (МНП) наблюдалось в 30 и 20 случаях соответственно. Другими первичными вспомогательными обследованиями были электрокардиограмма (ЭКГ) для выявления признаков ишемии миокарда (30, 34.1%) и эхокардиографию для выявления признаков дилатации желудочков или угнетения функции (56, 63,6%). Искусственная вентиляция легких использовалась у 27 новорожденных, пяти новорожденным потребовалась сердечно-легочная реанимация. Кроме того, 43 новорожденных получали поддержку экстракорпоральной мембранной оксигенации (ЭКМО). Лекарства включали антибиотики (16, 18,2%), ВВИГ (31, 35,2%), покапавир (2, 2,3%) и плеконарил (5, 5,7%). Кроме того, четверо новорожденных выжили после трансплантации сердца, а одному ребенку была проведена замена митрального клапана.Летальность составила 38,6% (34/88) у новорожденных с миокардитом, а 40,7% (22/54) выживших имели последствия или нуждались в кардиологических препаратах.

В 26 случаях в 10 исследованиях [8, 54,55,56,57,58,59,60,61,62] был диагностирован менингоэнцефалит с соотношением мужчин и женщин 11/10. Проявления менингоэнцефалита у матери и других членов семьи выявлены в пяти и трех случаях соответственно. Серотипы энтеровирусов включали четыре случая эховируса (эховирус 6 в одном, эховирус 30 в двух, эховирус 31 в одном), семь случаев CVB (CVB1 в четырех, CVB2 в двух, CVB3 в одном) и один случай EV71. Признаки поражения ЦНС включали судороги (10, 38,5%), вялость (5, 19,2%), раздражительность (9, 34,6%), тонико-клонические движения верхних конечностей (1, 3,8%), правосторонний гемипарез. (1, 3,8%), слабый рвотный рефлекс (1, 3,8%) и полный родничок (1, 3,8%). Осложнения центрального несахарного диабета возникли у одного новорожденного. Повреждение белого вещества было обнаружено с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) в 21 случае, а в 16 случаях на УЗИ головного мозга была обнаружена обширная перивентрикулярная эхогенность.Четверо новорожденных получали искусственную вентиляцию легких, а двоим вводили ВВИГ. В общей сложности 23 из 26 новорожденных выжили, а неврологические последствия были отмечены у шести.

Другие редкие осложнения показаны в таблице 2, включая гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (ГЛГ) [63,64,65,66], легочное кровотечение [67], легочную гипоплазию [68], стойкую легочную гипертензию [69], недостаточность костного мозга [ 70] и врожденных поражений кожи [71]. Среди шести новорожденных с ГЛГ у четырех перед родами развилась лихорадка, боль в животе и гриппоподобные симптомы.У всех новорожденных заболевание развилось в течение 5 дней. Пять новорожденных лечили ВВИГ. В итоге один новорожденный умер, а другому в возрасте 2 месяцев сделали трансплантацию печени. В четырех случаях, состоящих из двух пар близнецов с легочным кровотечением, у обеих матерей в день родов развилась лихорадка и другие симптомы. Начальный возраст двух наборов близнецов был 7 дней и 5 дней соответственно. Только один новорожденный выжил с легкой формой заболевания. Отмечен единичный случай легочной гипоплазии, характеризующейся полной недостаточностью развития терминальных дыхательных единиц.Эховирус 11 был положительным в амниотической жидкости. Новорожденный родился на сроке гестации 38 недель и умер через час. Другой случай связан с внутриутробной эховирусной инфекцией 11 с персистирующей легочной гипертензией и пневмонией. Новорожденный умер через 36 часов после рождения. Также был случай недостаточности костного мозга и сопутствующей энтеровирусной инфекции. Аспирация костного мозга и биопсия выявили гипоцеллюлярность. Новорожденному, наконец, стало лучше. Также сообщалось о мальчике с врожденной диссеминированной папуло-везикулярной, узловатой, буллезной и язвенно-некротической сыпью.Впоследствии у него развилась пневмония, кардит и гепатит. CVB3 был идентифицирован в сыворотке новорожденного. Мальчик выжил с осложнениями в возрасте 6 месяцев.

Таблица 2 Клинические особенности тяжелых энтеровирусных инфекций новорожденных с редкими осложнениями (%)

Неонатальная энтеровирусная инфекция: вирусология, серология и эффекты внутривенного иммуноглобулина | Клинические инфекционные болезни

Получить помощь с доступом

Институциональный доступ

Доступ к контенту с ограниченным доступом в Oxford Academic часто предоставляется посредством институциональных подписок и покупок. Если вы являетесь членом учреждения с активной учетной записью, вы можете получить доступ к контенту следующими способами:

Доступ на основе IP

Как правило, доступ предоставляется через институциональную сеть к диапазону IP-адресов. Эта аутентификация происходит автоматически, и невозможно выйти из учетной записи с проверкой подлинности IP.

Войти через свое учреждение

Выберите этот вариант, чтобы получить удаленный доступ за пределами вашего учреждения.

Технология Shibboleth/Open Athens используется для обеспечения единого входа между веб-сайтом вашего учебного заведения и Oxford Academic.

  1. Щелкните Войти через свое учреждение.
  2. Выберите свое учреждение из предоставленного списка, после чего вы перейдете на веб-сайт вашего учреждения для входа.
  3. Находясь на сайте учреждения, используйте учетные данные, предоставленные вашим учреждением. Не используйте личную учетную запись Oxford Academic.
  4. После успешного входа вы вернетесь в Oxford Academic.

Если вашего учреждения нет в списке или вы не можете войти на веб-сайт своего учреждения, обратитесь к своему библиотекарю или администратору.

Войти с помощью читательского билета

Введите номер своего читательского билета, чтобы войти в систему. Если вы не можете войти в систему, обратитесь к своему библиотекарю.

Члены общества

Многие общества предлагают своим членам доступ к своим журналам с помощью единого входа между веб-сайтом общества и Oxford Academic. Из журнала Oxford Academic:

  1. Щелкните Войти через сайт сообщества.
  2. При посещении сайта общества используйте учетные данные, предоставленные этим обществом. Не используйте личную учетную запись Oxford Academic.
  3. После успешного входа вы вернетесь в Oxford Academic.

Если у вас нет учетной записи сообщества или вы забыли свое имя пользователя или пароль, обратитесь в свое общество.

Некоторые общества используют личные аккаунты Oxford Academic для своих членов.

Личный кабинет

Личную учетную запись можно использовать для получения оповещений по электронной почте, сохранения результатов поиска, покупки контента и активации подписок.

Некоторые общества используют личные учетные записи Oxford Academic для предоставления доступа своим членам.

Институциональная администрация

Для библиотекарей и администраторов ваша личная учетная запись также предоставляет доступ к управлению институциональной учетной записью. Здесь вы найдете параметры для просмотра и активации подписок, управления институциональными настройками и параметрами доступа, доступа к статистике использования и т. д.

Просмотр учетных записей, вошедших в систему

Вы можете одновременно войти в свою личную учетную запись и учетную запись своего учреждения.Щелкните значок учетной записи в левом верхнем углу, чтобы просмотреть учетные записи, в которые вы вошли, и получить доступ к функциям управления учетной записью.

Выполнен вход, но нет доступа к содержимому

Oxford Academic предлагает широкий ассортимент продукции. Подписка учреждения может не распространяться на контент, к которому вы пытаетесь получить доступ. Если вы считаете, что у вас должен быть доступ к этому контенту, обратитесь к своему библиотекарю.

Определение протеолитического ландшафта при энтеровирусной инфекции

Образец цитирования: Saeed M, Kapell S, Hertz NT, Wu X, Bell K, Ashbrook AW, et al.(2020)Определение протеолитического ландшафта при энтеровирусной инфекции. ПЛОС Патог 16(9): е1008927. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927

Редактор: Берт Л. Семлер, Калифорнийский университет, Ирвин, США

Получено: 20 мая 2020 г.; Принято: 24 августа 2020 г .; Опубликовано: 30 сентября 2020 г.

Авторское право: © 2020 Saeed et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в рукописи и файлах вспомогательной информации.

Финансирование: Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения, грантом NIAID R01 AI091707 (для CMR), грантом NCDIR 2P41GM109824-06 и R01 2R01GM112108-05 (для JDA) и грантом Institut Mérieux (для MS и CMR). M.F-T был поддержан Novo Nordic Foundation, Шведским советом по медицинским исследованиям и Программой стратегических исследований Каролинского института в области диабета.Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Вирусы захватывают или разрушают механизмы клетки-хозяина, чтобы создать благоприятную среду для своего размножения. Один из способов сделать это — расщепить белки-хозяева. Некоторые вирусы кодируют одну или несколько протеаз, которые расщепляют клеточные белки во время инфекции пространственно и временно регулируемым образом, в то время как другие вирусы рекрутируют протеазы хозяина, чтобы стимулировать их репликацию.За прошедшие годы многочисленные белки, участвующие в различных клеточных процессах, включая экспрессию генов, аутофагию, апоптоз, везикулярный транспорт и противовирусный иммунитет, были идентифицированы как протеолитические мишени при вирусной инфекции [1-4]. Изучение этих расщеплений помогло раскрыть сложное взаимодействие между вирусами и их хозяевами, а также продвинуло наше понимание клеточной биологии. Однако технические ограничения означают, что мишени вирусных протеаз обычно идентифицируются по одной, поэтому полная степень протеолиза, вызванного инфекцией, остается неизвестной.В этом исследовании мы сообщаем о первом всестороннем обзоре белков-хозяев, расщепленных при энтеровирусной инфекции.

Энтеровирусы являются одной из ведущих причин заболеваний человека во всем мире. Род энтеровирусов, относящийся к семейству Picornaviridae , включает более 300 генотипов, сгруппированных в 10 видов энтеровирусов (EV) (от EV-A до EV-J) и три вида риновирусов (RV) (от RV-A до RV-C) (обзор в [5]). Энтеровирусы вызывают ряд заболеваний, в том числе простуду (риновирусы человека [HRV]), ящур (вирус Коксаки, энтеровирус A71 [EV71] и др.), острый геморрагический конъюнктивит (энтеровирус D70 [EV70]). ), полиомиелит (полиовирус) и недавние вспышки острого вялого паралича (возможно, связанные с энтеровирусом D68 и др.).В некоторых случаях инфекция может привести к тяжелым неврологическим заболеваниям, миокардиту и энцефалиту, и эти вирусы вызывают эпидемии и смерти во всем мире. Энтеровирусы, такие как полиовирус, также использовались в течение десятилетий в качестве инструментов для исследования взаимодействия вирус-хозяин.

Энтеровирусы обладают геномом с положительной цепью РНК длиной около 7500 нуклеотидов, который состоит из длинной открытой рамки считывания (ORF), окруженной нетранслируемыми областями (UTR). 5′-UTR содержит внутренний сайт входа в рибосому (IRES), который управляет кэп-независимой трансляцией ORF с образованием большого полипротеина-предшественника [6, 7].В этот полипротеин встроены две протеазы, 2A (2A pro ) и 3C (3C pro ), которые расщепляют полипротеин ко- и посттрансляционно с высвобождением 11 зрелых белков [8, 9]. В контексте процессинга вирусных полипротеинов 2A pro отвечает только за собственное отщепление от предшествующего структурного белка [10], а все остальные расщепления, кроме одного, катализируются 3C pro [8]. Окончательное расщепление происходит по автокаталитическому механизму [11].

Энтеровирусные протеазы также расщепляют белки хозяина.Это было впервые описано в 1980-х годах, когда было показано, что полиовирус 2A pro расщепляет eIF4G, важный фактор инициации трансляции, необходимый для кэп-зависимой трансляции мРНК хозяина [12]. В результате расщепления eIF4G трансляция хозяина отключается, в то время как кэп-независимая трансляция вирусной РНК остается интактной. Считается, что, блокируя трансляцию хозяина, полиовирус и другие энтеровирусы подавляют экспрессию антивирусных генов и тем самым создают благоприятную среду для репликации вируса.После открытия расщепления eIF4G еще несколько клеточных белков были идентифицированы как субстраты энтеровирусных протеаз. Тем не менее, большинство этих белков были обнаружены либо подходами-кандидатами, двумерным (2D) гель-электрофорезом, либо предсказаниями in silico [13, 14]. Эти методы, хотя и полезны, ограничены в своей способности обеспечить глобальное представление о протеолизе в клетке.

Благодаря недавним достижениям в протеомике в настоящее время доступны несколько методов, которые позволяют беспристрастно маркировать вновь генерируемые N-концы белка (neo N-концы), например, полученные в результате протеолитического расщепления [15-17].В этих методах используется тот факт, что около 85% N-концов формирующихся белков в клетках млекопитающих посттрансляционно модифицируются, в основном путем ацетилирования, и поэтому недоступны для мечения [18]. В одном методе мечения используется биоинженерная протеинлигаза, субтилигаза, для добавления биотинилированного пептида к нео-N-концам, продуцируемым внутри клеток [16]. Затем биотинилированные белки захватывают на гранулах стрептавидина, подвергают трипсинизации на гранулах, высвобождают из гранул посредством расщепления протеазой вируса травления табака (TEV) и идентифицируют с помощью высокочувствительной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС).Биотинилированный пептид сконструирован таким образом, что после удаления протеазой TEV он оставляет неприродную аминокислотную метку (аминомасляную кислоту или Abu), прикрепленную к N-концу нео, что позволяет с высокой степенью достоверности идентифицировать меченые пептиды. на неспецифически связанном фоне [19]. Этот метод широко используется для изучения каспаз-опосредованного протеолиза при апоптозе [16, 19, 20]. Другой N-терминомный подход был недавно использован для исследования клеточных белков, расщепленных энтеровирусом 3C pro в клеточных лизатах [21], но этот метод не применялся в контексте инфекции.

В этом отчете мы адаптировали подход к маркировке субтилигазой для глобальной идентификации белков, расщепленных при вирусной инфекции. Применив этот метод к пяти вирусам различных видов энтеровирусов, мы идентифицировали множество известных и новых клеточных мишеней, которые мы затем проверили с помощью ортогональных подходов. Среди недавно идентифицированных субстратов расщепления был LSM14A, резидентный белок p , ранее участвовавший в защите от некоторых РНК- и ДНК-вирусов [22]. Мы показываем, что энтеровирусное 2A pro -опосредованное расщепление этого белка предотвращает усиление противовирусной защиты.

Результаты

Сотни случаев расщепления белка-хозяина обнаружены после заражения вирусом Коксаки B3

Чтобы составить карту ландшафта индуцированного энтеровирусами протеолиза, мы адаптировали метод субтилигазы для мечения недавно расщепленных N-концов в инфицированных клетках [20]. Мы решили использовать вирус Коксаки B3 (CVB3) для начального анализа, поскольку его известные протеолитические мишени можно использовать для проверки. В качестве первого шага мы оптимизировали протокол, чтобы уменьшить количество необходимых клеток и обеспечить одновременную работу с несколькими образцами, что было необходимым условием для временного анализа вирусной инфекции с несколькими повторами.Обработка клеток ультразвуком в буфере, содержащем 1% SDS, с последующим удалением лизатов из детергента перед реакцией мечения обеспечивала оптимальный лизис (согласно измерению солюбилизации гистона h4, рис. S1A) и надежное опосредованное субтилигазой биотинилирование (рис. S1B). Оптимизация этапов постлизиса показала, что 3 мг клеточного белка на реакцию мечения было достаточно для идентификации известных энтеровирусных мишеней, в отличие от 30 мг на реакцию, о которых сообщалось ранее для обнаружения каспаз-опосредованного расщепления [20].Точно так же мы оптимизировали условия промывки, чтобы получить больший сигнал по сравнению с фоном. Затем мы определили время инфицирования клеток HeLa с использованием CVB3, кодирующего репортерный ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP) (eGFP/CVB3). GFP-положительные клетки были впервые обнаружены примерно через 3 часа после заражения (h.p.i.), и инфекция достигла своего пика в течение следующего часа (рис. S2A). Цитопатические эффекты (ЦПЭ) инфекции были очевидны через 6 л.с.

Оптимизированный метод субтилигазы использовали для мечения свободных N-концов в неинфицированных и CVB3-инфицированных клетках HeLa в разное время после заражения (рис. 1А).Недавно расщепленные пептиды в каждом лизате анализировали с помощью ЖХ-МС/МС с тремя образцами для каждой временной точки. В этом эксперименте мы идентифицировали много свободных N-концов как в инфицированных, так и в неинфицированных клетках. Интересно, что величина мечения увеличивалась по мере прогрессирования инфекции, что свидетельствует об увеличении числа нео-N-концов (рис. 1B и рис. S2B). Действительно, если учитывать только пептиды, которые появились по крайней мере в двух из трех повторов для ЖХ-МС/МС, количество доступных для метки пептидов в инфицированных клетках увеличилось с 868 (через 2 ч.л.с.) до 995 (при 4 л.с.) до 1458 (при 6 л.с.) (табл. 1). Из 995 пептидов, идентифицированных при 4 х.ч.

Рис. 1. Анализ расщепления белков в клетках HeLa при инфицировании eGFP/CVB3.

(A) Рабочий процесс мечения субтилигазы. Клетки HeLa либо инфицировали вирусом, либо оставляли неинфицированными, лизировали в SDS-буфере, а лизаты, содержащие 3 мг общего белка, подвергали обогащению N-концов белка субтилигазой.Идентификация ЖХ-МС/МС и биоинформатический анализ обогащенных N-концов позволили получить список вирус-индуцированных белковых расщеплений. (B) Клетки HeLa, инфицированные eGFP/CVB3, собирали в трех экземплярах в указанное время после заражения с последующим мечением субтилигазой. Каждая строка указывает на уникальный пептид, меченный Abu, а красный и черный цвета используются для обозначения присутствия и отсутствия пептида соответственно. Пептиды представлены в произвольном порядке. (C) Частоты аминокислот P1 и P1′ от уникальных N-концов, идентифицированных в указанные моменты времени после заражения.В этот анализ были включены N-концы, присутствующие по крайней мере в двух из трех повторов. (D) Частота расщепления белков, полученных из указанных пар аминокислот P1 и P1′, в разное время после заражения. Учитывали только расщепления, наблюдаемые как минимум в двух из трех повторностей.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.g001

Таблица 1. Резюме протеолиза, индуцированного CVB3, в клетках HeLa.

Общее количество пептидов и соответствующих белков в ложных и инфицированных вирусом клетках сведено в таблицу.Для нескольких белков было идентифицировано несколько пептидов, что позволяет предположить, что эти белки были расщеплены более чем в одном сайте. Также указаны номера сколов по указанным мотивам.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.t001

Вирусные и клеточные протеазы проявляют предпочтения в отношении сайтов расщепления, что позволяет терминальным остаткам продуктов расщепления давать ключи к пониманию идентичности протеазы. Энтеровирусы 2A pro и 3C pro представляют собой химотрипсиноподобные протеазы с цистеиновым нуклеофилом и расщепляют вирусный полипротеин по консенсусным мотивам, в основном определяемым остатками P1 и P1´.3C pro проявляет строгую сайт-специфичность в отношении глутамина (Q) в положении P1 и глицина (G) > аланина (A) > серина (S) в положении P1´ [8, 13]. Интересно, что 21% N-концов, идентифицированных в CVB3-инфицированных клетках при 6 h.p.i. были получены из расщепления глутамина P1, в отличие от 4% в неинфицированных клетках (рис. 1C: верхняя панель и таблица 1). Кроме того, мы наблюдали в 10 и 30 раз больше расщеплений QG при 4 и 6 л.с., соответственно, по сравнению с неинфицированными клетками (рис. 1D: левая панель и таблица 1).Количество расщеплений Q-A и Q-S также увеличивалось при инфицировании (табл. 1). В отличие от 3C pro , 2A pro может переносить несколько остатков P1, хотя предпочитает треонин (T), тирозин (Y) и фенилаланин (F). Однако у него есть строгие требования к G в позиции P1´. В соответствии с этим расщепление глицина P1´ увеличилось в 3 раза при заражении вирусом (рис. 1C: нижняя панель и таблица 1). По мере развития инфекции наблюдалось больше расщеплений в мотивах 2A pro (рис. 1D: средняя и правая панели и рис. S3).Наибольшее увеличение наблюдалось для расщепления Т-Г, которое выросло с 0,2% при 2 л.с.и. до 4,5% при 6 л.с. (Рис. 1D: правая панель). Хотя некоторые из этих расщеплений могут быть катализированы протеазами хозяина, тот факт, что они наблюдались обычно на гораздо более низких уровнях в неинфицированных клетках, подтверждает гипотезу о том, что они были опосредованы вирусными протеазами.

Известно, что на более поздних стадиях инфекции энтеровирусы вызывают апоптоз. Эффекторные протеазы апоптотического пути, каспазы, расщепляют свои мишени между аспартатом (D) и малыми аминокислотами (G > S > A) [23, 24].При 6 л.с., когда клетки демонстрировали значительный ЦПД, 134 нео-N-конца были получены в результате расщепления аспартата P1, в отличие от 41 при 4 л.с.и (таблица 1). Это говорит о том, что каспазы также влияют на протеолитический ландшафт клеток, инфицированных CVB3.

В целом, эти результаты показывают, что в CVB3-инфицированных клетках происходят сотни расщеплений, и что многие из полученных пептидов демонстрируют признаки расщепления 2A pro , 3C pro и каспазы. Кроме того, эти результаты свидетельствуют о том, что модифицированные условия мечения субтилигазы хорошо подходят для идентификации расщепления белка в инфицированных вирусом клетках.

Идентифицировано и подтверждено множество новых мишеней протеаз CVB3

В качестве начальной проверки подхода к мечению субтилигазой мы проверили набор данных всех недавно расщепленных белков на наличие известных мишеней CVB3. Сообщалось, что CVB3 расщепляет ряд белков-хозяев, включая дистрофин, eIF4G, HNRPD, HNRPM, MAVS, NUP98, PABP, RIP3 и TRIF [1]. В нашем наборе данных присутствовали пептиды большинства этих белков, за исключением RIP3, который не экспрессируется в клетках HeLa [25], и дистрофина.Самое главное, пептиды для eIF4G, HNRPD, HNRPM, MAVS и PABP соответствовали известным сайтам расщепления в этих белках, хотя были обнаружены и дополнительные пептиды. Эти результаты подтвердили правильность нашего подхода к маркировке.

Затем мы проверили наш набор данных на наличие новых целей расщепления. Чтобы обеспечить высокую достоверность идентификации мишеней, мы включили только те белки, которые были обнаружены по крайней мере в двух из трех инфицированных, но ни в одном из неинфицированных повторов.Точно так же, чтобы исключить неспецифические расщепления, мы включили белки, которые были расщеплены на ранних стадиях инфекции до того, как клетки достигли цитотоксичности. Это дало список из 173 белков (файл S1), из которых около 81 был расщеплен по мотивам, которые, как известно, являются мишенями для протеаз CVB3. Эти белки участвуют во многих клеточных процессах, включая транскрипцию, редактирование РНК, сплайсинг, транспорт и оборот, поддержание цитоскелета, деление клеток, репарацию ДНК, эндоцитоз и секрецию, а также врожденный иммунитет.Мы выбрали 20 из этих 81 белков, а также 14 мишеней поздних стадий (ARFP1, CAPR1, CHERP, DBNL, F120A, HTSF1, MAPK3, MATR3, NUFP2, PANX1, RBP56, SHRM1, SP130 и STAT3) и шесть известных мишеней. EIF4G, HNRPD, HNRPM, MAVS, NUP98 и USO1), идентифицированные в нашем наборе данных, для проверочных исследований (рис. 2B).

Рис. 2. Подтверждение расщепления белка, идентифицированного мечением субтилигазой.

(A) Клетки HeLa инфицировали eGFP/CVB3 и лизировали при 0, 2, 3, 4, 5 и 6 h.p.i. с последующим вестерн-блот-анализом указанных белков.Для каждой временной точки загружали равное количество общего белка, определенное количественно с помощью анализа BCA. Экспрессию GFP использовали для мониторинга прогрессирования инфекции (нижняя панель). Черные сплошные стрелки указывают на полноразмерный белок, а продукты расщепления показаны красными пунктирными стрелками. (B) Показан момент времени после заражения, когда впервые стало обнаруживаться расщепление (изображения вестерн-блоттинга показаны на рис. S4). Некоторые белки (CAPR1, HTSF1, MAPK3, MAVS, SP130, STAT3 и USO1), которые расщепляются только через 6 ч.p.i. с помощью протеомного анализа были включены в качестве контроля. Было обнаружено, что белки со звездочками расщепляются при 4 h.p.i. по протеомному анализу, но только при 6 л.с. методом вестерн-блоттинга. Положение и идентичность остатков P1, идентифицированных на 4 или 6 h.i. также показаны биологические функции расщепленных белков.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.g002

Чтобы подтвердить расщепление белков-кандидатов-мишеней в присутствии вируса, мы инфицировали клетки HeLa с помощью eGFP/CVB3 и отслеживали белки с течением времени с помощью вестерн-блоттинга. (Фиг.2А и S4 Фиг.1).Примечательно, что все протестированные белки были расщеплены, причем около 75% из них давали рисунок полос, соответствующий сайту (сайтам) расщепления, идентифицированному с помощью деградации. Для некоторых белков полноразмерные молекулы уменьшались в изобилии, не давая обнаруживаемого продукта расщепления. Вероятно, это связано с изменением эпитопа, распознаваемого используемыми антителами, или прогрессирующей деградацией продуктов расщепления. Чтобы проверить, было ли изменение эпитопа ответственным за отсутствие обнаруживаемого продукта расщепления, мы создали версии некоторых белков с двойной меткой, слитые на их N-конце с меткой V5 и на их С-конце с меткой HA.В случае расщепления белка вестерн-блоттинг с анти-V5 и анти-HA антителами идентифицирует N-концевые и С-концевые продукты расщепления соответственно. Из пяти протестированных белков четыре имели обнаруживаемые продукты расщепления (S5 Fig).

Важно отметить, что результаты вестерн-блоттинга подтвердили время протеолитического расщепления, наблюдаемое в наборе данных протеомики. EIF4G и NUP98 расщеплялись в течение 2 часов после инфицирования, в то время как другие белки в основном расщеплялись при 4 h.p.i. Это был момент времени, когда GFP стал обнаруживаться, что свидетельствует о перекрытии между репликацией вируса и расщеплением белка (рис. 2B).Для 12 белков расщепление было обнаружено только при 5 h.p.i. Среди них семь соответствовали результатам протеомики, в то время как остальные пять были расщеплены ранее в эксперименте по протеомике, что позволяет предположить, что обогащение субтилигазой может быть более чувствительным, чем вестерн-блоттинг. В целом, эти результаты показывают, что мечение N-концевой субтилигазы является надежным методом для идентификации мишеней расщепления, связанных с инфекцией, и что мечение хорошо коррелирует со временем событий расщепления.

Очищенные рекомбинантные протеазы CVB3 расщепляют идентифицированные белки-мишени

in vitro

Чтобы проверить, ответственны ли протеазы CVB3 за выявленные расщепления, мы провели анализ расщепления in vitro .Для этого мы инкубировали лизаты клеток HeLa с очищенными рекомбинантными протеазами CVB3 2A pro и 3C pro или их каталитически неактивными версиями и отслеживали расщепление 38 идентифицированных субстратов с помощью вестерн-блоттинга (рис. 3 и S6). Следует отметить, что хотя этот метод ранее использовался для тестирования расщепления белков [21, 26], на результаты могут сильно влиять качество белковых препаратов, состав буфера, соотношение протеаз и белков и скорость реакции. условия.Поэтому мы сначала оптимизировали все эти параметры. Подготовка клеточных лизатов в мягком детергенте (0,1% Triton-X) и инкубация лизатов с вирусными протеазами при соотношении протеазы к белку 1:200 для 2A pro и 1:4 для 3C pro дали оптимальные результаты.

Рис. 3. In vitro Анализ расщепления идентифицированных белков.

(A) Лизаты клеток HeLa (200 мкг белка) инкубировали с CVB3 2A pro или его каталитически неактивным мутантом C110A (1 мкг), или CVB3 3C pro или его каталитически неактивным мутантом C147A (100 мкг) при 37°С. °С в течение 3 ч и анализировали вестерн-блоттингом.Лизаты из неинфицированных и инфицированных eGFP/CVB3 клеток HeLa были включены в качестве положительных контролей. Полноразмерный белок указан сплошными черными стрелками, а продукты расщепления указаны красными пунктирными стрелками. (B) Белки сгруппированы в три категории в зависимости от того, было ли расщепление опосредовано 2A pro , 3C pro или обоими (изображения вестерн-блоттинга показаны на S6 Fig).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.g003

Анализ in vitro показал, что присутствие протеаз CVB3 приводило к расщеплению всех 38 наблюдаемых белков.Результаты анализа in vitro в основном согласуются с чувствительностью к протеазам, предсказанной по сайтам расщепления. В общем, сайты с глутамином P1 расщеплялись 3C pro , а остальные катализировались 2A pro . В то время как большинство белков подвергались расщеплению только один раз, некоторые подвергались многократному воздействию одних и тех же или разных протеаз. Например, HNRPM неоднократно подвергался атакам со стороны 2A pro (S6 Fig, 4 th lane, средняя панель).Напротив, MATR3, который давал два продукта C-концевого расщепления в инфицированных клетках, был независимо нацелен как 2A pro , так и 3C pro в двух разных сайтах (рис. 3). В соответствии с результатами инфекции, некоторые белки (ARFP1, F120A, HTF4, NHEJ1, NUFP2, PANX1 и SP130) уменьшались в количестве, но не давали обнаруживаемых продуктов расщепления. В целом, эти результаты предполагают, что вирусные протеазы были ответственны за большинство расщеплений, идентифицированных в ранние моменты времени в CVB3-инфицированных клетках.

Идентификация белков, предназначенных для расщепления несколькими энтеровирусами

Нам было интересно сравнить протеолитический ландшафт инфекции CVB3 с другими энтеровирусами и определить, существуют ли общие мишени для протеолиза. Для этого мы использовали панель энтеровирусов, ассоциированных с различными болезненными состояниями человека: риновирус человека A16 (HRV), полиовирус 1 (PV), энтеровирус D70 (EV70) и энтеровирус A71 (EV71). Во-первых, мы проверили кинетику роста этих вирусов в клетках HeLa, отслеживая накопление вирусных белков (S7 Fig).PV проявлял те же характеристики, что и CVB3, при этом большинство клеток экспрессировали вирусные антигены при 4 h.p.i. и проявляющие цитотоксичность при 6 л.с. EV70 и EV71 имели более медленную кинетику роста, достигая пика инфекции при 6 h.i. ВСР была самой медленной из всех с наибольшим количеством инфицированных клеток, наблюдаемых при 9 л.с. Исходя из этого, мы выбрали 3, 4 и 6 л.с. моменты времени для PV, 4, 6 и 8 л.с. для EV70 и EV71, а также 6, 9 и 12 л.с. для ВСР. Для каждого вируса в качестве контроля служили неинфицированные клетки HeLa.

Протеомный анализ меченных субтилигазой нео N-концов клеток, инфицированных этими вирусами, выявил 218 (PV), 278 (HRV), 274 (EV70) и 206 (EV71) потенциальных хозяев-мишеней для расщепления. Это было сопоставимо с 211 белками-хозяевами, идентифицированными для CVB3 (рис. 4А и файл S2). Как и ожидалось, исходя из структурного и функционального сходства энтеровирусных протеаз [1], многие из идентифицированных белков-мишеней перекрываются между одним или несколькими вирусами; Было обнаружено, что 46 белков расщепляются всеми протестированными вирусами.Некоторые расщепления оказались специфичными для одного вируса или подмножества вирусов; однако, если не подтверждено ортогональными подходами, трудно с уверенностью заключить, что конкретное расщепление является вирус-специфическим. Это связано с тем, что мечение субтилигазой, как и другие подходы, основанные на протеомике, может не идентифицировать все расщепления белков в образцах, а пептиды также могут быть исключены строгим конвейером анализа данных. Анализ кластеризации белков и обогащения генной онтологии (GO) белков, идентифицированных с высокой достоверностью по крайней мере для двух из пяти вирусов (рис. 4B и 4C), показал обогащение белками путей экспрессии генов, таких как сплайсинг РНК, экспорт мРНК из ядра, инициация трансляции и метаболизм РНК.Это согласуется с предыдущими наблюдениями о том, что энтеровирусы сильно ингибируют экспрессию генов (обзор в [27]).

Рис. 4. Анализ белков, на которые нацелены энтеровирусов .

(A) Диаграмма Венна, показывающая количество расщепленных белков, общих или уникальных для разных вирусов. (B) Сеть взаимодействия белков STRING, на которую нацелены по крайней мере два из пяти энтеровирусов, как показано в Cytoscape (отсоединенные узлы не показаны). Окрашивание указывает на группы из пяти или более белков, идентифицированных алгоритмом кластеризации MCODE как сильно взаимосвязанные.Наиболее значительно обогащенные биологические процессы суммированы под сетью. Расщепленные белки, подтвержденные вестерн-блоттингом, показаны в узлах ромбовидной формы. (C) Топ-15 значительно обогатили биологические процессы, на которые нацелены по крайней мере два из пяти вирусов.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.g004

Чтобы идентифицировать распространенные субстраты энтеровирусных протеаз и сузить число кандидатов до управляемого количества образцов, мы сосредоточились на 40 белках, которые мы ранее проверили. для CVB3.Большинство этих белков были обнаружены как расщепленные во всех полученных наборах данных протеомики, что указывает на то, что они были нацелены на все протестированные вирусы (рис. S8). Некоторые белки (I2BP2, DSRAD и MAVS), по-видимому, расщепляются подмножеством вирусов, при этом два (DDX6 и DHX9) обнаруживаются только в клетках, инфицированных CVB3 и EV71. Важно отметить, что для большинства белков одни и те же пептиды были обнаружены в наборах данных всех протестированных вирусов, что указывает на специфическое расщепление, а не на неспецифическое расщепление.

Чтобы подтвердить результаты протеомики для панели энтеровирусов, мы заразили клетки HeLa каждым вирусом и проверили расщепление 40 кандидатов-мишеней с помощью вестерн-блоттинга в два разных времени после заражения (рис. 5 и рис. S9).Чтобы определить, расщепляют ли эти субстраты также различные вирусные протеазы, мы заразили клетки двумя неэнтеровирусами: вирусом венесуэльского конского энцефалита (VEEV), РНК-вирусом с положительной цепью из семейства Togaviridae , и вирусом везикулярного стоматита (VSV), РНК-вирус с отрицательной цепью из семейства Rhabdoviridae . Результаты вестерн-блоттинга в значительной степени подтвердили закономерности расщепления, выявленные в экспериментах по мечению субтилигазой. Например, в соответствии с результатами протеомики, DDX6 и DHX9 расщеплялись исключительно CVB3 и EV71, хотя для DHX9 в инфицированных PV клетках была отмечена слабая полоса, указывающая на расщепление в другом месте (рис. 5).В отличие от протеомных результатов вестерн-блоттинг показал, что MAVS был мишенью для всех протестированных вирусов и, что интересно, расщеплялся в разных местах разными энтеровирусами. Это также верно для F120A, где более заметные полосы расщепления наблюдались для HRV по сравнению с CVB3 и PV, несмотря на то, что все эти вирусы вызывали одинаковое снижение полноразмерного белка (S9 Fig). Это может быть связано с различной стабильностью продуктов расщепления, генерируемых разными вирусами.По большей части заражение VEEV и VSV не приводило к расщеплению протестированных клеточных белков, за исключением неполного расщепления CT2NL VSV и некоторой деградации MAVS обоими вирусами. В целом, эти результаты снова указывают на то, что мечение субтилигазой является мощным методом для идентификации событий расщепления белка, связанных с вирусной инфекцией, и что выявленные расщепления в значительной степени специфичны для энтеровирусной инфекции, а не для панвирусной.

Рис. 5. Проверка белков-мишеней для нескольких энтеровирусов.

(A) Клетки HeLa, инфицированные CVB3 (eGFP-Коксакивирус B3), PV (полиовирус типа 1), HRV (человеческий риновирус A16), EV70 (энтеровирус D-70), EV71 (энтеровирус A-71), VEEV (венесуэльский вирус энцефалита лошадей) или VSV (вирус везикулярного стоматита) лизировали в указанные моменты времени, и равные количества общего белка подвергали вестерн-блоттингу с указанными антителами. Черные сплошные и красные пунктирные стрелки указывают на полноразмерный белок и продукты расщепления соответственно. (B) Результаты вестерн-блоттинга суммированы, чтобы показать белки, на которые обычно нацелены все пять энтеровирусов, и белки, уникальные для подмножества вирусов (изображения вестерн-блоттинга показаны на рис. S9).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.g005

Поскольку наш анализ до сих пор ограничивался клетками HeLa, мы затем исследовали протеолиз идентифицированных мишеней с помощью eGFP/CVB3 и PV в различных типах клеток ( S10 рис). Панель клеточных линий включала Caco-2, линию кишечного эпителия, представляющую первичный вход CVB3 и PV в организм человека, RD, линию скелетных мышц, представляющую один из основных сайтов репликации PV in vivo , и SK- N-SH, нейронная линия, вероятно, имеющая отношение к нейротропному потенциалу энтеровирусов.Мы также заразили нейральные клетки-предшественники (NPC), полученные из эмбриональных стволовых клеток, для проверки расщепления белка в более физиологически релевантных условиях. Поскольку CVB3 не инфицировал клетки RD, а лишь минимально инфицировал клетки SK-N-SH, мы исключили эти клетки из анализа CVB3. Примечательно, что было обнаружено, что выбранные белки расщепляются во всех протестированных типах клеток, а картины полос в основном напоминают наблюдаемые в клетках HeLa. В совокупности полученные результаты показывают, что энтеровирусы в основном расщепляют перекрывающийся набор белков и что эти расщепления одинаковы для различных типов клеток.

LSM14A представляет собой новую мишень врожденного иммунного ответа, расщепляемую и инактивируемую протеазами энтеровируса

LSM14A был идентифицирован в нашем анализе как белок, широко используемый энтеровирусами в различных типах клеток (рис. 5 и S10, рис.) и зрелых нейронах (S11, рис.). Этот белок в основном находится в p тельцах, цитоплазматических рибонуклеопротеиновых гранулах, участвующих в обмене мРНК, и ранее был вовлечен в противовирусный иммунитет против некоторых ДНК- и РНК-вирусов [22].Наши исследования показали, что расщепление LSM14A опосредовано 2A pro (рис. 3) в сайте узнавания с P1’G. Чтобы проверить этот сайт-мишень, мы заменили глицин P1′ (G147) либо на аланин (A), либо на глутамат. (E) и проверили, расщепляются ли эти мутанты при заражении вирусом (фиг. 6A). Интересно, что белки G147A и G147E все еще расщеплялись, хотя и менее эффективно. Кроме того, размер продукта расщепления был больше, чем у белка дикого типа, что позволяет предположить, что мутантные белки были расщеплены в альтернативном, расположенном выше сайте (рис. 6В).

Рис. 6. Проверка расщепления LSM14A.

(A) Схема конструкций LSM14A, созданных для проверки сайта расщепления. Сайт расщепления и фланкирующие восемь аминокислот показаны на рисунке. Мутированный глицин P1 показан красным. (B) Клетки HeLa, трансдуцированные для стабильной экспрессии конструкций LSM14A, были инфицированы eGFP/CVB3 или PV, и расщепление LSM14A было проанализировано вестерн-блоттингом. Блоты исследовали с помощью мышиных антител против V5 и кроличьих антител против HA с последующим обнаружением с помощью IRDye 680RD козьего антимышиного IgG (красный канал) и IRDye 800CW козьего антикроличьего IgG (зеленый канал).FL, полноразмерный белок; CT, С-концевой продукт расщепления; NT, N-концевой продукт расщепления; М, макет; РЕЗЮМЕ; эГФП/CVB3; PV, полиовирус; UBC, Убиквитин С.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.g006

Затем мы провели функциональные анализы, чтобы проверить, делает ли расщепление LSM14A белок нефункциональным. Сообщалось, что LSM14A усиливает врожденный иммунитет при заражении вирусом Сендай (SeV) [22]. Чтобы подтвердить это, мы экспрессировали LSM14A в клетках 293T, содержащих репортерные плазмиды ISRE-FLuc и RL-RLuc, и инфицировали эти клетки SeV.Инфекция SeV должна активировать IRF3/7, который связывается с интерферон-стимулируемым ответным элементом (ISRE) в репортере ISRE-FLuc, чтобы стимулировать экспрессию люциферазы Firefly (FLuc). Для сравнения, люцифераза Renilla (Rluc) экспрессируется из RL-RLuc под контролем промотора CMV, и ее уровни должны оставаться стабильными. Как и ожидалось, экспрессия LSM14A усиливала опосредованную SeV активацию ISRE дозозависимым образом, подтверждая роль этого белка во врожденном иммунитете (рис. 7A: правая панель).Интересно, однако, что LSM14A не проявлял активности в отсутствие SeV (рис. 7А: левая панель). Это отличалось от другого врожденного иммунного сигнального фактора, MAVS (S12 Fig), и повышает вероятность того, что LSM14A играет роль в восприятии РНК.

Рис. 7. Функциональные анализы LSM14A.

(A) LSM14A активировал ISRE дозозависимым образом. Клетки 293T (30000 клеток на лунку в 48-луночных планшетах), экспрессирующие репортеры ISRE-FLuc и RL-RLuc, трансфицировали указанными количествами плазмид GFP (вектор) или LSM14A.На следующий день клетки оставляли неинфицированными (левая панель) или инфицированными SeV (правая панель) на 24 часа с последующим анализом люциферазы. Соотношение FLuc/RLuc рассчитывали и наносили на график как кратное увеличение относительно минимального количества используемой векторной плазмиды (6,25 нг). (B) Фрагменты расщепления LSM14A не активируют ISRE. Репортерные анализы с указанными мутантами LSM14A проводили аналогично А. Использовали концентрации ДНК 6,25, 12, 25 и 50 нг/лунку. (C) Опосредованное TEVP расщепление LSM14A блокирует его способность активировать ISRE.Клетки 293T, содержащие dox-индуцируемый TEVP и экспрессирующие репортеры ISRE-FLuc и RL-RLuc, трансфицировали 12,5 нг/лунку, 25 нг/лунку или 50 нг/лунку плазмиды LSM14A-TEVP с последующим инфицированием SeV. Указанное количество доксициклина добавляли в культуральную среду за 24 ч до трансфекции ДНК и сохраняли в течение всего эксперимента. Репортерный анализ был выполнен, как описано в A. (D) LSM14A требует RIG-I и MAVS для своей функции. Клетки 293T, нокаутированные по указанным генам, использовали для репортерных анализов, как описано в A (верхняя панель).Использовали 50 нг/лунку ДНК. Клетки тестировали на экспрессию указанных белков. Для обнаружения RIG-I и MDA5 клетки подвергали воздействию 5 нМ IFN-2a альфа в течение 48 часов. (E) MAVS не требует LSM14A для своей врожденной иммунной функции. Клоны клеток 293T, экспрессирующие или не экспрессирующие LSM14A, трансфицировали 12,5 нг/лунку MAVS и тестировали на активацию ISRE, как в А. Этот эксперимент проводили в отсутствие инфекции SeV. KO-пул был создан путем смешивания клонов клеток 293T, у которых была подтверждена потеря LSM14A.(F) SeV может активировать ISRE в отсутствие LSM14A. Клоны клеток 293T, использованные в E, были инфицированы SeV, и репортерная активность ISRE была измерена, как в A. Для всех экспериментов данные представлены как среднее +/- стандартное отклонение для трех образцов.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.g007

Мы использовали два подхода, чтобы проверить, как расщепление, опосредованное энтеровирусом, влияет на активность LSM14A. Во-первых, мы отдельно экспрессировали продукты расщепления в клетках 293T и тестировали их способность усиливать индуцированную SeV активацию ISRE.Как и следовало ожидать, отдельные продукты расщепления LSM14A не усиливали активность ISRE (фиг. 7B). Во втором подходе мы создали сайт распознавания протеазы TEV (TEV pro ) в LSM14A в месте расщепления энтеровируса 2A pro . Затем мы протестировали активацию ISRE в присутствии или отсутствии TEV pro . Важно отметить, что модифицированный LSM14A продемонстрировал сравнимую активацию ISRE-FLuc с его аналогом дикого типа в клетках 293T, что указывает на то, что вставка сайта расщепления TEV pro не нарушала его функцию (фиг. S13A).Однако в присутствии TEV pro модифицированный LSM14A подвергался расщеплению (фиг. S13B) и больше не мог усиливать SeV-опосредованную иммунную активацию (фиг. 7C). Эти результаты ясно показали, что N- и С-концевые продукты расщепления LSM14A не вызывают активации ISRE при инфицировании SeV.

Как именно LSM14A способствует противовирусному иммунитету, неизвестно. Чтобы получить представление о механизме LSM14A, мы исследовали его ISRE-активирующий потенциал в клетках 293T, лишенных различных компонентов противовирусной иммунной сигнализации.Отсутствие MAVS аннулировало способность LSM14A усиливать SeV-опосредованную иммунную передачу сигналов, что позволяет предположить, что LSM14A функционирует выше MAVS (рис. 7D). Истощение RIG-I (известный сенсор SeV) также блокирует активность LSM14A, указывая на то, что LSM14A может функционировать как кофактор RIG-I или, альтернативно, участвовать в передаче сигналов только после активации пути. Наконец, активность LSM14A не изменилась, когда STAT1 был нокаутирован (рис. 7D), что означает, что белок не работает через передачу сигналов интерферона.Чтобы дополнительно исследовать, функционирует ли LSM14A выше MAVS, мы создали нокаутные клетки LSM14A и исследовали способность MAVS индуцировать иммунную передачу сигналов в этих условиях. Активность MAVS оставалась в значительной степени неизменной после истощения LSM14A, что подтверждает гипотезу о том, что MAVS действует после LSM14A (рис. 7E). Чтобы изучить возможность того, что LSM14A является важным кофактором RIG-I, мы протестировали индуцированную SeV передачу иммунных сигналов в нокаутных клетках LSM14A. Интересно, что истощение LSM14A не подавляло SeV-опосредованную активацию ISRE (рис. 7F), что исключает роль LSM14A в качестве критического кофактора RIG-I.В совокупности оказывается, что LSM14A способствует, но не является существенным для передачи сигналов RIG-I в клетках 293T. Расщепление этого белка, наряду с расщеплением MAVS, может помочь энтеровирусам уклониться от защиты хозяина.

Обсуждение

Несмотря на все больше свидетельств того, что энтеровирусы используют протеолиз для модуляции или захвата механизма хозяина, истинная степень протеолиза в инфицированной вирусом клетке остается неизвестной. Здесь мы использовали относительно беспристрастный подход к N-терминомике, чтобы получить первый полный каталог клеточных белков, которые подвергаются расщеплению при энтеровирусной инфекции.Это привело к идентификации ряда известных и новых субстратов из различных клеточных путей. Как и ожидалось, исходя из структурного и функционального сходства энтеровирусных протеаз [1], многие из идентифицированных белков были мишенями для всех протестированных вирусов. Однако обнаружились некоторые интересные различия в паттернах расщепления. Например, как показано мечением на N-конце и вестерн-блоттингом, DDX6 и DSRAD эффективно расщеплялись только в клетках, инфицированных CVB3. Точно так же NUP98 и DHX9, по-видимому, были нацелены с разной эффективностью разными вирусами, в то время как MAVS и F120A расщеплялись всеми вирусами, но в разных местах.Важно отметить, что эти паттерны, хотя первоначально идентифицированные в клетках HeLa, были обнаружены во всех протестированных типах клеток, что указывает на то, что они отражают истинную биологию вируса-хозяина, а не артефакты клеточной культуры. Чтобы исследовать релевантность расщепленных белков, мы исследовали одного кандидата, LSM14A, и показали, что укороченные формы этого белка, генерируемые расщеплением, опосредованным энтеровирусом 2A pro , не вызывают активации ISRE в ответ на инфекцию SeV.

LSM14A, первоначально идентифицированный в 1998 году как мРНК-связывающий белок в ооцитах саламандры [28], в отчете 2012 года был вовлечен в передачу сигналов врожденного иммунитета при РНК- и ДНК-вирусных инфекциях [22].Используя SeV в качестве примера РНК-вируса и вирус простого герпеса-1 (HSV-1) в качестве примера ДНК-вируса, исследование 2012 года показало, что LSM14A усиливает активность ISRE в ответ на вирусную инфекцию. В соответствии с этим мы наблюдали дозозависимый эффект LSM14A на индуцированную SeV активацию ISRE в клетках 293T. Однако, когда LSM14A расщепляется 2A pro , он больше не может опосредовать SeV-индуцированную активацию ISRE, что указывает на потерю функции. LSM14A представляет собой белок из 463 а.о. с N-концевым доменом LSm из 76 а.о. (а.о. 1–76), за которым следует внутренне неструктурированная область около 200 а.о., а затем два С-концевых мотива, а именно бокс DFDF (а.о. 291–316) и блок FDF_TFG (aa 361–397) [22].С-концевая область белка необходима для связывания РНК и локализации p в организме [22, 29], двух характеристик, которые, как полагают, важны для противовирусной иммунной активности LSM14A. Однако эта область сама по себе не может опосредовать иммунную передачу сигналов и требует присутствия N-концевого домена LSm для активности. В соответствии с этим, когда N- и С-концевые домены LSM14A разделяются энтеровирусным расщеплением, белок становится неактивным. К сожалению, мы не смогли показать прямую связь LSM14A с энтеровирусной инфекцией из-за ряда биологических и технических ограничений, таких как устойчивость вирусной инфекции к большинству клеточных линий, избыточность врожденных иммунных путей и расщепление некоторых других иммунных компонентов этим путем. группа вирусов.Например, известно, что энтеровирусы нацеливаются на RIG-I [30] и MAVS, два белка, которые, как предполагают наши эксперименты с нокаутом, необходимы для активности LSM14A (рис. 7D). Это уменьшило полезность типичных стратегий сверхэкспрессии и нокаута для расшифровки функции LSM14A во время энтеровирусной инфекции.

Подходы N-терминомики одновременно выявляют идентичность расщепляемых белков и точное место в белке, где происходит расщепление. Это позволило нам искать белки, на которые непосредственно нацелены энтеровирусные протеазы.Сначала мы создали список кандидатов, которые были обнаружены расщепленными по крайней мере в двух из трех реплик, инфицированных CVB3, но ни в одной неинфицированной реплике, а затем сопоставили этот список с мотивами консенсусной последовательности, на которые, как известно, нацелены энтеровирусные протеазы. Это дало ряд белков из различных клеточных процессов, многие из которых ранее были вовлечены в репликацию энтеровирусов. Например, были идентифицированы белки, необходимые для различных стадий экспрессии генов-хозяев, аутофагии и противовирусной иммунной сигнализации.Сходным образом, некоторые компоненты цитоскелета, цитоплазматические рибонуклеопротеиновые гранулы и комплекс ядерных пор были среди белков-мишеней для расщепления. Хорошо известно, что энтеровирусы снижают синтез нового белка за счет отключения трансляции на ранних стадиях инфекции, что подтверждается расщеплением eIF4G всего через 2 ч.п.и. Наше открытие, что протеолиз нацелен на многочисленные дополнительные факторы, участвующие в экспрессии генов, подчеркивает то, как эти вирусы реконструируют клетку в своих интересах. Важно отметить, что вестерн-блот-анализ инфицированных клеток подтвердил все протестированные расщепления, а анализ in vitro дополнительно подтвердил, что расщепления были опосредованы вирусными протеазами.Однако следует отметить, что анализ in vitro не полностью исключает возможность расщепления, опосредованного протеазой-хозяином. Возможно, что смешивание энтеровирусной протеазы с лизатом клеток HeLa стимулировало протеазу хозяина, которая затем нацеливалась на свои субстраты.

По мере того, как инфицированные вирусом клетки приближались к полной цитотоксичности, количество расщепленных белков существенно возрастало. Вероятно, это был кумулятивный эффект высоких уровней вирусных протеаз на клетку и потери субклеточной компартментализации, что позволило вирусным протеазам контактировать с большим количеством клеточных белков.Кроме того, обширные изменения во внутриклеточной среде могут приводить к активации протеаз хозяина, и мы действительно наблюдали всплеск активности каспаз, когда CPE становился очевидным. Делая вывод о том, что расщепление на поздних стадиях, вероятно, будет неспецифическим, мы включили только те белки, которые расщепляются на ранних стадиях инфекции, при перечислении мишеней с высокой степенью достоверности. Однако стоит отметить, что несколько функционально важных расщеплений, как сообщается, происходят на поздних стадиях энтеровирусной инфекции. Например, многие белки, которые энтеровирусы рекрутируют на ранних стадиях инфекции, но нуждаются в элиминации на более поздних стадиях, удаляются с помощью расщепления, опосредованного протеазами [25].Кроме того, хотя в большинстве случаев расщепление делает субстрат нефункциональным, бывают случаи, когда расщепление придает белку новую функцию, полезную для вируса. Например, RIP3, киназа, которая регулирует аутофагию и организует некротическую гибель клеток, является важным фактором-хозяином для ранней фазы репликации CVB3. Позже при инфекции RIP3 расщепляется CVB3 3C pro , что снижает его способность опосредовать некротическую гибель клеток и генерирует С-концевой продукт расщепления, который используется CVB3 для индукции ненекротической формы гибели клеток [25].Хотя в этом исследовании мы сосредоточились на ранних расщеплениях, понимание расщеплений на поздних стадиях может быть не менее важным.

Появление различных подходов к N-терминомике вызвало интерес к роли вирусных протеаз во взаимодействиях вирус-хозяин. Недавно Jagdeo et al. использовали TAILS, другой N-терминомный подход, для инвентаризации клеточных белков, расщепленных энтеровирусом 3C pro [21]. Они смешали клеточные лизаты HeLa или HL-1 (клетки сердечной мышцы мышей) с очищенной вирусной протеазой из CVB3 или PV и идентифицировали белки, которые расщепляются диким типом, но не являются каталитически неактивными 3C pro .Это дало список из 34 субстратов с высокой степенью достоверности, семь из которых авторы впоследствии подтвердили в инфицированных вирусом клетках. Интересно, что шесть из этих семи субстратов присутствовали в нашем наборе данных, и, что важно, для одного субстрата, RIPK1, где авторы увидели расхождение между результатами TAILS и вестерн-блоттинга, субтилигазный метод, который мы использовали, идентифицировал сайт расщепления, который соответствовал продуктам, наблюдаемым в вестерн-блот. Это подчеркивает важность применения подходов N-терминомики к инфицированным вирусом клеткам, а не к клеточным лизатам, смешанным с протеазой, поскольку первый, вероятно, даст более точную и полную информацию о мишенях-хозяевах и сайтах расщепления.Еще одним преимуществом использования системы вирусной инфекции является то, что она позволяет идентифицировать события расщепления, регулируемые во времени и пространстве.

В общем и целом, этот отчет представляет собой первое всестороннее представление о протеолизе в инфицированных энтеровирусами клетках и добавляет LSM14A в растущий список белков-хозяев, которые энтеровирусы нацелены на расщепление для создания благоприятной для вирусов среды. Перечень белков-кандидатов, представленный в этом исследовании, обеспечивает основу для будущих исследований сложного взаимодействия между энтеровирусами и их клетками-хозяевами, а подход и конвейер могут быть применены для определения ландшафта протеолиза при любом столкновении вируса с хозяином.

Материалы и методы

Клетки и вирусы

Клетки карциномы шейки матки человека HeLa (ATCC CCL-2), клетки эмбриональной почки человека HEK293T (ATCC CRL-3216), клетки RD рабдомиосаркомы мышц человека (ATCC CCL-136) и клетки нейробластомы человека SK-N-SH (ATCC HTB- 11) содержали в минимальной основной среде Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Клетки колоректальной аденокарциномы человека Caco-2 (ATCC HTB-37) выращивали в среде DMEM, содержащей 20% FBS.Клетки 293T, дефицитные по RIG-I, MDA5, MAVS и STAT1, были описаны ранее и любезно предоставлены Veit Hornung (Университет Бонна, Германия) [31].

Для нейральных клеток-предшественников (NPC) мы сначала дифференцировали эмбриональные стволовые клетки человека (hESC) в нейроэктодермальные клетки, используя метод двойного ингибирования SMAD (Chambers et al., Nature Biotechnology. 2009). Вкратце, чЭСК диссоциировали на отдельные клетки с помощью аккутазы и высевали на планшеты, покрытые матригелем, в присутствии 10 мкМ ингибитора ROCK (Y-27632) для достижения приблизительно 90% слияния на следующий день.Дифференцировку индуцировали с помощью SRM (нокаутная DMEM/F12, содержащая 15% замещения нокаутной сыворотки (KOSR) и 1% GlutaMax) с добавлением 10 мкМ SB431542 и 200 нМ Noggin в течение пяти-семи дней. Клетки слитой эктодермы пассировали и выдерживали еще одну неделю в индукционной среде, содержащей двойные ингибиторы SMAD. Полученные NPC затем поддерживали в среде предшественников нейронов (Knockout DMEM/F12, содержащей 2% добавки StemPro Neural Supplement и 1% GlutaMax) с добавлением 20 нг/мл bFGF и 20 нг/мл EGF.Культуры NPC ежедневно получали свежую среду. Реагенты, используемые для дифференцировки стволовых клеток, были получены от следующих поставщиков: Matrigel (# 356230), Corning; ингибитор ROCK Y-27632 (# 72308), STEMCELL Technologies; КОСР (№ 10828028), Life Technologies; GlutaMax (# 35050–061), Life Technologies: SB431542 (# 1614), Tocris Bioscience; Кочан (№120-10С), Пепротех; Приложение StemPro Neural (# A10508-01), Life Technologies; bFGF AA 10–155 (№ PHG0024), Life Technologies; EGF человека без содержания животных (№ AF-100-015), Peprotech; и нокаут DMEM/F-12 (# A1370801), Life Technologies.

За исключением EV71, все энтеровирусы, используемые в этом исследовании, были извлечены из инфекционных клонов кДНК, полученных от различных исследователей: pMKS1-GFP [32] (обозначаемый в этой статье как eGFP/CVB3) был получен от доктора Дж. Линдси Уиттон. Исследовательского института Скриппса, Ла-Холья; полиовирус (pT7-Manony) [33] и энтеровирус человека 70 (pDNE9) [34] от доктора Винсента Раканьелло из Колумбийского университета, Нью-Йорк; и штамм человеческого риновируса A16 (pA16) [35] от доктора Энн Палменберг из Университета Висконсина, Мэдисон.Энтеровирус человека 71 был получен из ресурсов BEI (номер по каталогу NR-471). Штамм Cantell вируса Сендай (SeV), используемый для экспериментов по индукции врожденного иммунитета, был создан в лаборатории доктора Адольфо Гарсиа-Састре из Медицинской школы Икана на горе Синай, штат Нью-Йорк, путем инокуляции в аллантоисную полость 10- суточных куриных яиц с эмбрионами. После инкубации при 37°С в течение 48 ч аллантоисную жидкость собирали и титровали путем гемагглютинации куриных эритроцитов. GFP-меченная версия вакцинного штамма VEEV TC83 (VEEV-GFP) [36] была получена от Ильи Фролова из Техасского университета в Галвестоне, а GFP-меченый VSV (VSV-GFP) [37] был получен от Джона Роуза из Йельский университет, Нью-Хейвен.

Вирусные инфекции

Крупномасштабные эксперименты : Для каждого эксперимента по заражению клетки HeLa помещали в двадцать четыре чашки диаметром 150 см (по шесть чашек для каждой из четырех временных точек) с плотностью 10 миллионов клеток на чашку. На следующий день клетки заражали вирусом при множественности заражения (m.o.i.) 5 бляшкообразующих единиц (БОЕ)/клетку. Поскольку eGFP/CVB3 не давал бляшек, мы не могли рассчитать m.o.i. для этого вируса. Таким образом, мы оптимизировали условия заражения для eGFP/CVB3, используя различные разведения исходного вируса и выбирая разведение, которое давало 100% GFP-положительных клеток через 4 часа.Пи. Для заражения вирус разводили в 5 мл opti-MEM и адсорбировали на монослое клеток при 37°С в течение 1 часа. Затем инокулят вируса удаляли и в каждую чашку добавляли 25 мл DMEM/10% FBS. Клетки собирали в указанное время, определенное в ходе предшествующих экспериментов по заражению в небольшом масштабе, описанных ниже. Для каждой временной точки мы разделили шесть чашек на три набора по две чашки в каждом и объединили клетки из каждого набора, чтобы получить в общей сложности три повтора. Неинфицированные клетки собирали одновременно с последним моментом времени заражения.Для сбора мы соскоблили клетки в раствор для диссоциации клеток без ферментов (Millipore: # S-014-C) и осадили их центрифугированием при 1000 x g в течение 5 мин. Осадки клеток затем мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

Маломасштабные эксперименты : Для определения оптимального m.o.i. и время сбора для крупномасштабных экспериментов, мы высевали клетки HeLa в 24-луночные планшеты с плотностью 175 000 клеток на лунку и позволяли им расти в течение ночи при 37°C.Мы заразили клетки на m.o.i. 1, 5 или 10, сначала разбавляя вирус в 100 мкл opti-MEM, а затем инкубируя клетки с этим инокулятом при 37°C в течение 1 часа. Затем инокулят вируса удаляли и добавляли свежую среду DMEM/10% FBS. Затем клетки фиксировали в разное время после заражения 4% параформальдегидом (PFA) и окрашивали антителами против вирусных антигенов.

Антитела и химические вещества

Антитела, используемые для иммунофлуоресценции, включают клон антитела против PV 1 583-G8-G2-A4 (Millipore: #MAB8560), клон антитела против EV-D70 74-5G (Millipore; #MAB843), антитело против EV-A71 (GeneTex; #GTX132339) и клон антитела против риновируса R16-7 (LifeSpan BioSciences; #LS-C200976), антитело против LSM14A (Bethyl Laboratories; #A305-103A).Большинство антител для вестерн-блоттинга были приобретены в Beethyl Laboratories. К ним относятся кроличьи поликлональные антитела против ARFP1 (#A304-676A), AR14B (#A302-233A), CAPR1 (#A303-882A), CBX8 (#A300-882A), CD2AP (#A304-728A), CHERP (#A304). -621A), DBNL (#A303-351A), DDX6 (#A300-461A), DHX9 (#A300-855A), EP300 (#A300-358A), F120A (#A303-889A), HNRPM (#A303-910A) ), HTF4 (# A300-754A), HTSF1 (# A302-023A), I2BP2 (# A303-190A), LSM14A (# A305-103A), MAPK3 (# A304-305A), MATR3 (# A300-591A), MAVS (# A300-782A), NEDD1 (# A304-545A), NHEJ1 (# A300-730A), NUFP2 (# A301-600A), NUP98 (# A301-786A), PP6R1 (# A300-968A), PRP17 ( № А303-700А), РБП56 (№ А300-309А), СП130 (№ А302-491А) и СРПК2 (№ А302-467А).Следующие антитела были приобретены у Proteintech: CT2NL (#25523-1-AP), PANX1 (#12595-1-AP), SHRM1 (#18218-1-AP), TLE3 (#11372-1-AP) и USO1. (#13509-1-АР).

Антитела, приобретенные в компании Cell Signaling Technology, включают кроличьи моноклональные антитела против BRD4 (#13440), кроличьи поликлональные антитела против eIF4G (#2498), кроличьи поликлональные антитела против FOXK1 (#12025), кроличьи моноклональные антитела против HNRPD (#12382), и поликлональные анти-STAT3 кролика (#9132). Дополнительные первичные антитела включают мышиные моноклональные антитела против DSRAD (Santa Cruz Biotechnology; #sc271854), кроличьи поликлональные антитела против SCRIB (GeneTex; #GTX107692), кроличьи поликлональные антитела против HA (Abcam; #ab9110), мышиные моноклональные антитела против V5 (ThermoFisher Scientific). ; #MA5-15253) и антитело против стрептавидина, конъюгированное с IRDye 800CW (Rockland Immunochemicals; S000-31).Вторичные антитела, использованные для вестерн-блоттинга, включали козьи антимышиные IRDye 680RD (LI-COR; 926–68070) и козьи антикроличьи IRDye 800CW (LI-COR; 926–32211).

Следующие химические вещества были приобретены у Sigma: ацетонитрил (№ 271004), TCEP (№ 75259), йодацетамид (I1149), AEBSF (№ A8456) и PMSF (№ P7626). Ингибитор протеазы E-64 (#324890) и ингибитор панкаспазы Z-VAD (#219007) были приобретены у EMD Millipore. Трипсин для секвенирования был приобретен у Promega (№ V5113), а лизилэндопептидаза — у Wako (№ 125–05061).

Плазмиды

кДНК

LSM14A амплифицировали с помощью ПЦР из общей кДНК клеток HeLa и присоединяли к ее 5′- и 3′-концам метки V5 и HA соответственно. Праймеры для ПЦР были сконструированы для введения сайта расщепления Bamh2 выше метки V5 и сайта расщепления Nhe1 ниже метки HA. Используя эти сайты расщепления, мы клонировали кДНК LSM14A в лентивирусный вектор pLOC и экспрессионную плазмиду pcDNA3.1 для получения pLOC-LSM14A и pcDNA3.1-LSM14A соответственно. Для дефектных по расщеплению мутантов LSM14A мы заменили глицин в положении 147 аланином или глутаминовой кислотой с помощью ПЦР с перекрытием.N-концевой V5-меченый убиквитин (Ubi) сливали с аминокислотой 147–463 LSM14A с получением pV5-Ubi-LSM14A. Плазмида pISRE-FLuc, содержащая управляемый ISRE репортер люциферазы Firefly, была получена от Stratagene (#219089), а pRL-RLuc, содержащая управляемый промотором CMV репортер люциферазы Renilla, была получена путем модификации плазмиды pRL-HL, любезно предоставленной доктором Стэнли Лемоном. [38]. Плазмида pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) (Addgene # 481239) с малой направляющей РНК (sgRNA) была подарена Feng Zhang. Мы разработали три sgRNA для нокаута CRISPR LSM14A с использованием хрусталя.tefor.net: sgRNA1 (экзон1), 5’-AGCGGGGGCACCCCTTACAT-3’; sgRNA2 (экзон 2), 5’-GGTGGTATTGGACGATCTGT-3’; и sgRNA3 (экзон 4), 5’-TTACCCCAAAGTAGTGCGGT-3’. Затем sgRNA клонировали в плазмиду PX459 для последующей трансфекции в клетки.

Производство и очистка рекомбинантных белков

протеаза
TEV.

Рекомбинантная протеаза TEV была получена в Escherichia coli , как описано ранее [39]. Вкратце, меченный His 6 мутант TEV S219V клонировали в вектор pET и трансформировали в клетки BL21 DE3.На следующий день мы инокулировали одну бактериальную колонию в 50 мл среды LB и выращивали в течение ночи при 37°С. Через 24 часа 2,5 мл полученной в течение ночи бактериальной культуры переносили в 1 л свежей среды LB и клетки выращивали в инкубаторе со встряхиванием при 37°C до тех пор, пока OD 600 не достигала ~ 0,5. Клетки охлаждали на льду и экспрессию белка индуцировали 1 мМ IPTG. После встряхивания при 30°С в течение 4 ч клетки собирали центрифугированием. Осадки клеток ресуспендировали в буфере для хранения (20% сахарозы и 20 мМ Трис, рН 8), мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

Для очистки протеазы TEV клетки лизировали ультразвуком в присутствии 500 мМ NaCl, 20 мМ фосфата Na/K, 1 мМ PMSF, 0,5% IGEPAL (октилфенилполиэтиленгликоль), 15 мМ имидазола, 1 мМ β-ME (β-меркаптоэтанол), 50 мкг/мл лизоцима, 2 мкг/мл ДНКазы I и 2 мкг/мл РНКазы A. материал. Белок, содержащийся в супернатанте, улавливали на гранулах агарозы Ni-NTA (Qiagen) путем инкубации супернатанта с гранулами в течение 1 часа при 4°C.Затем шарики наносили на колонку Econo-Pac (Bio-Rad) и промывали 25 объемами колонки промывочного буфера (500 мМ NaCl, 20 мМ фосфата Na/K, 15 мМ имидазола, 20 мМ Трис, pH 8, и 1 мМ ß-mE). Связанный белок элюировали с гранул элюирующим буфером (500 мМ NaCl, 20 мМ фосфата Na/K, 250 мМ имидазола, 20 мМ Трис pH8 и 1 мМ ß-ME) и дополнительно очищали гель-фильтрацией с использованием HiPrep. Колонка 26/60 Sephacryl S-200 HR (GE Healthcare).

Субтилигаза.

Бактерии Bacillus subtilis BG2864, содержащие плазмиду, несущую субтилигазу, выращивали в течение ночи при 37°C в среде 2X TY, содержащей 12.5 мкг/мл левомицетина. Культуру центрифугировали при 4500 x g в течение 15 мин при 4°С и отбрасывали бактериальный осадок. Супернатант помещали на магнитную мешалку и белок в супернатанте осаждали медленным добавлением сульфата аммония при 4°С. После 1 ч перемешивания белок осаждали центрифугированием при 10000× г в течение 30 мин при 4°С. Осадок растворяли в буфере, содержащем 5 мМ ДТТ и 25 мМ ацетата натрия, рН 5,0, с последующим добавлением трех объемов этанола до получения конечной концентрации 75%.После еще одного 30-минутного перемешивания на мешалке раствор центрифугировали при 5000× g в течение 15 минут при 4°C. Белковый осадок ресуспендировали в указанном выше буфере (5 мМ ДТТ и 25 мМ ацетата натрия, рН 5,0) и подвергали диализу против 9 л того же буфера в течение ночи при 4°С. После диализа белок последовательно очищали на ионообменных и гель-фильтрационных колонках (HiTrap SP HP 5 мл и Superdex 200 10/300GL; GE Healthcare). Концентрацию очищенного белка устанавливали на уровне 100 мкМ и хранили при -80°С.

протеаз CVB3.

Для 2A pro дикого типа, 3C pro дикого типа и C147A 3C pro бактерии BL21 (DE3) T1R pRARE2, содержащие плазмиды с His-мечеными протеазными конструкциями, выращивали в течение ночи в присутствии 100 мкг/мл канамицина и 34 мкг/мл хлорамфеникола. Когда OD 600 достигала 0,3, экспрессию белка индуцировали обработкой в ​​течение ночи 0,5 мМ IPTG. Для 2A pro мы использовали среду для автоиндукции (Thermo: K6803), а также добавили 1 мкМ ZnCl 2 для облегчения укладки белка.Затем культуры центрифугировали при 4500 x g в течение 10 мин и осадки лизировали импульсным ультразвуком в присутствии 100 мМ HEPES, 500 мМ NaCl, 10% глицерина, 10 мМ имидазола и 0,5 мМ TCEP, pH 8,0. Лизаты центрифугировали при 49000 x g в течение 20 мин и супернатанты фильтровали через фильтры 0,45 мкм. Затем образцы загружали в ÄKTA Xpress (GE Healthcare) и очищали сначала с помощью колонки IMAC 5 мл HisTrap HP (GE Healthcare), а затем с помощью колонки для гель-фильтрации HiLoad 16/60 Superdex 75 (GE Healthcare).Поскольку наши конструкции содержали сайт расщепления протеазы TEV, клонированный между меткой His и N-концом протеазы CVB3, мы удалили метку, инкубируя образцы с протеазой TEV при соотношении протеазы к белку 1:25 при комнатной температуре. температура 2ч. Затем расщепленную His-метку удаляли из белковых препаратов путем пропускания образцов через колонку HisTrap HP. Поток собирали и концентрировали до 1 мг/мл в буфере для хранения (25 мМ HEPES, pH 7,5, 140 мМ NaCl, 2 мМ TCEP, 10% глицерин) с последующей лиофилизацией и хранением при -80°C.

Для C110A 2A pro His-меченую протеазу клонировали в плазмиду pBVboostFGIIWPRE C43 и трансформировали в бактерии BL21 DE3. Бактерии выращивали в 5 мМ глюкозе и 7 мкг/мл гентамицина до OD 600 , равной 0,4, и экспрессию белка индуцировали обработкой в ​​течение ночи 0,1 мМ IPTG при 28°C. Бактериальную культуру затем центрифугировали при 4500× g в течение 10 мин и лизировали ультразвуком в буфере для связывания (50 мМ Трис, рН 8, 0,5 М NaCl, 10 мМ имидазол), содержащем 30 мкг/мл лизоцима.Лизат клеток центрифугировали при 10000 x g в течение 20 мин при 4°C и супернатант инкубировали с шариками агарозы Ni-NTA. Захваченный белок элюировали с гранул, используя 50 мМ Трис, рН 8, 0,5 М NaCl и 500 мМ имидазол с последующим удалением имидазола с помощью центробежного фильтра VivaSpin Turbo 10K (Sartorius). Затем белок очищали анионообменной хроматографией с использованием Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), лиофилизировали в буфере для хранения (25 мМ HEPES, pH 8, 140 мМ NaCl) и хранили при -80°C.

Подготовка TEVest4

Пептид TEVest4 представляет собой биотинилированный пептид с концевым амином, состоящий из последовательности: Biotin-eAhx-eLys-Gly-Gly-Thr-Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Abu-Glc-Arg-Nh3. Пептид был синтезирован методом твердофазного пептидного синтеза с небольшими изменениями оригинального протокола [40]

Выделение N-концевого пептида

Для мечения замороженные осадки клеток лизировали ультразвуком в буфере, содержащем 1% SDS, 100 мМ бицина, pH 8.0,5 мМ ЭДТА, 50 мкМ z-VAD-fmk, 50 мкМ E-64, 500 мкМ AEBSF и 50 мкМ PMSF. Лизаты сначала пропускали через QIAshredders (Qiagen; № 79654) для измельчения оставшихся нуклеиновых кислот, а затем через колонки для удаления детергентов (ThermoFisher Scientific; № 87777) для удаления SDS. Общий клеточный белок во всех образцах был установлен на уровне 15 мкг/мкл для получения всего 3 мг белка в объеме 200 мкл. Лизаты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа с биотинилированным пептидным эфиром (TEVest4; исходный раствор 10 мМ в ДМСО) и очищенной рекомбинантной субтилигазой (исходный раствор 100 мМ; см. ниже) до получения конечных концентраций 1 мМ и 1 мкМ соответственно.Невключенные пептидные эфиры удаляли осаждением ацетонитрилом.

Затем высушенные на воздухе белковые гранулы растворяли в 6М гидрохлориде гуанидина (GnHCl), содержащем 100 мМ бицина, рН 8,0, и 10 мМ TCEP. Образцы инкубировали при 95°С до полного растворения осадка. Затем следовала реакция алкилирования, при которой образцы инкубировали с 10 мМ йодацетамидом (IAM) при комнатной температуре в течение 45 минут в темноте. Реакцию IAM затем гасили 10 мМ DTT и биотинилированные белки улавливали в течение ночи на иммобилизованных гранулах агарозы NeutrAvidin (ThermoFisher Scientific; #29202).

Гранулы промывали пять раз промывочным буфером, содержащим 4М GnHCl и 100 мМ бицина, и расщепляли в течение ночи при 37°C в буфере для расщепления (100 мМ бикарбоната аммония, 1М GnHCl, 100 мМ NaCl, 5 мМ CaCl 2 ), содержащем смесь 3 мкг трипсина секвенирования и 1,5 мкг лизилэндопептидазы. После расщепления шарики пять раз промывали промывочным буфером и ресуспендировали в протеазном буфере TEV, содержащем 100 мМ бикарбоната аммония, 1 мМ ЭДТА и 2 мМ ДТТ. Пептиды высвобождали путем расщепления 40 мкг протеазы TEV в течение 6 ч при комнатной температуре и обессоливали наконечниками C18 Empore (3M) StAGE, приготовленными на месте [41].

ЖХ-МС/МС

Мы высушивали обессоленные образцы и растворяли в 2% ацетонитриле и 2% муравьиной кислоте перед анализом с помощью одномерной обращенно-фазовой нано-ЖХ-МС/МС (Q-Exactive Plus, ThermoFisher Scientific). Для обращенно-фазовой жидкостной хроматографии (ЖХ) использовали колонки C 18 длиной 12 см и внутренним диаметром 75 мкм, заполненные шариками с размером частиц 3 мкм (Nikkyo Technologies, Япония), и доставляли 80-минутный градиент, возрастающий от 5 % B/95% A (A: 0,1% муравьиной кислоты в воде, B: 0.1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитриле) до 40% B/60% A при скорости потока 300 нл/мин (Dionex 3000, ThermoFisher Scientific). Пептиды концентрировали с использованием колонки-ловушки (ThermoFisher Scientific, #164564-CMD) перед разделением. MS1 сканировался от m/z 300 до m/z 1400. Для сбора данных HCD MS/MS использовалось разрешение 17 500 с автоматической регулировкой усиления 5e 5 и максимальным временем ввода 100 мс. Самая низкая масса была установлена ​​на m/z 140. Для масс-спектрометра Q-Exactive Plus мы подвергли 20 наиболее распространенных многозарядных (2+, 3+, 4+ и 5+) пептидов тандемной МС.Первичные данные будут предоставлены по запросу.

Интерпретация спектров МС/МС

Данные

ЖХ-МС/МС анализировали с использованием программного обеспечения Proteome Discoverer 2.3.0.523 в сочетании с MASCOT v. 2.3. Данные тандемного МС были сопоставлены с протеомом человека UniProt (выпуск от сентября 2018 г.), объединенным с обычными загрязнителями и последовательностями протеома вируса. Минимальная длина пептида была установлена ​​на уровне 7 аминокислот. Был применен фильтр 5% ложных открытий (FDR), рассчитанный Percolator [42].Были использованы ограничения поиска полутриптического расщепления. Все цистеины считали карбамидометилированными. Окисление метионина и N-концевой C4H7NO (α-аминомасляная кислота, Abu), последнее приводящее к увеличению массы на 85,052764 Да, были разрешены в качестве переменных модификаций. Интенсивность пептидов и спектральные подсчеты использовали для количественного определения.

Биоинформатический анализ

Качественный анализ был проведен для идентификации белков, расщепленных в инфицированных вирусом клетках. Для этого мы сначала потребовали, чтобы пептиды были мечены Abu, идентифицированы с высокой достоверностью по крайней мере в двух инфицированных повторах и отсутствовали в неинфицированных клетках.Затем мы собрали идентификаторы генов, присвоенные расщепленным пептидам, чтобы создать списки генов с продуктами, расщепленными после инфекции. Мы исключили нечеловеческие белки. Для идентификации белков, которые обычно расщепляются среди энтеровирусов, мы использовали следующие фильтры: 1) пептид должен быть идентифицирован с высокой степенью достоверности как минимум для одного вируса, 2) пептид должен присутствовать как минимум в двух инфицированных повторах в течение как минимум двух вирусов, и 3) пептид не должен обнаруживаться ни в одной неинфицированной реплике.Чтобы учесть откусывание экзопептидазы (разрыв), мы написали, проверили и внедрили сценарий в R, позволяющий удалить из наших окончательных анализов те пептиды, которые предположительно возникли в результате активности экзопептидазы. Затем мы вводим окончательный список белков в «Инструмент поиска повторяющихся экземпляров соседних генов» (STRING) на https://string-db.org [43]. В результирующую сеть взаимодействий были включены только те взаимодействия, которые соответствовали критериям «самой высокой достоверности» в базе данных STRING.Затем эта сеть была экспортирована и визуализирована в Cytoscape [44], а кластеры в сети были идентифицированы с использованием алгоритма кластеризации MCODE [45], реализованного в плагине Cytoscape «clusterMaker2» [46]. Мы функционально профилировали кластеры, которые содержали более пяти белков, используя анализ обогащения GO (генная онтология), реализованный в R-пакете «clusterProfiler» (версия 3.12.0) [47]. Значимыми считались термины GO с обогащением p с поправкой на FDR менее 0,05.При выборе белков для проверки вестерн-блоттингом мы требовали, чтобы аминокислоты P1 и P1´ соответствовали специфичности сайта расщепления энтеровирусной протеазы.

Анализ расщепления in vitro

клетки HeLa лизировали ультразвуком в буфере, содержащем 100 мМ бицина, рН 8,0, 140 мМ NaCl, 5 мМ ДТТ и 0,1% Тритон-Х. Затем лизат центрифугировали при ~21000× g в течение 20 мин при 4°C для осаждения нерастворимого материала. Концентрацию белка измеряли с помощью анализа BCA с использованием набора для анализа белка Pierce BCA (ThermoFisher Scientific; № 23225) и устанавливали на уровне 2 мкг/мкл.Для анализа расщепления CVB3 2A pro мы смешали 100 мкл клеточного лизата (200 мкг белка) с 1 мкг протеазы дикого типа или каталитически неактивной, чтобы получить соотношение протеазы к белку 1:200. Для анализа расщепления CVB3 3C pro мы использовали соотношение протеазы и белка 1:2. Эти отношения были определены в экспериментальных экспериментах, в которых клеточные лизаты и протеазы смешивали в различных пропорциях, а расщепление известных субстратов использовалось в качестве ориентира. Реакцию расщепления проводили при 37°C в течение 3 часов с последующим добавлением красителя для загрузки образца и 10-минутной инкубации при 70°C.Расщепление белков тестировали вестерн-блоттингом.

Генерация нокаутных клеток LSM14A

клетки 293T трансфицировали плазмидой PX459, содержащей sgRNA LSM14A, с использованием реагента для трансфекции ДНК Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific, #11668030). Мы подготовили три популяции клеток; сначала трансфицировали пустым PX459 в качестве контроля; во-вторых, трансфицированных комбинацией sgRNA 1 и 2; и в-третьих, с комбинацией sgRNA 2 и 3. Трансфицированные клетки подвергались воздействию 2.5 мкг/мл пуромицина в течение 48 ч, начиная с 36 ч после трансфекции, а затем восстанавливали в течение 3 дней в среде, не содержащей пуромицин. Одноклеточные клоны получали путем посева клеток в 96-луночные планшеты с плотностью 0,7 клеток на лунку. Полученные клеточные клоны подвергали скринингу на экспрессию LSM14A с помощью вестерн-блоттинга.

Анализ люциферазы

Для двойного анализа люциферазы клетки высевали в 48-луночные планшеты с плотностью 30 000 клеток на лунку в объеме 250 мкл и выращивали в течение ночи при 37°C.На следующий день клетки в каждой лунке трансфицировали 50 нг плазмидной ДНК pISRE-FLuc и 2,5 нг плазмидной ДНК pRL-RLuc вместе с различными концентрациями представляющих интерес генов (например, pcDNA3.1-LSM14A, pcDNA3. 1-MAVS или pcDNA3.1-GFP, именуемые в настоящем документе «вектором»). XtremeGENE 9 (Roche; № 06365787001) использовали в качестве реагента для трансфекции ДНК. На следующий день клетки инфицировали SeV в течение 24 часов и лизировали 1X буфером для пассивного лизиса (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя.Активность люциферазы Firefly и Renilla измеряли с помощью репортерной системы анализа двойной люциферазы (Promega) с использованием люминометра Lumat LB9507 (EG & G Berthold, Бад-Вильдбад, Германия).

Вспомогательная информация

S1 Рис. Оптимизация мечения субтилигазы.

(A) Лизис SDS дал лучшие результаты, чем лизис Triton-X. Клетки HeLa, инфицированные eGFP/CVB3, лизировали либо в 1% Triton-X, либо в 1% SDS. Опыт проводили в трехкратной повторности. Все лизаты SDS были обработаны ультразвуком, в то время как из трех лизатов Triton-X два были обработаны ультразвуком, а один остался необработанным.Вестерн-блоттинг проводили с антителами против гистона h4 и против GFP. (B) Истощение SDS перед мечением было необходимо для реакции субтилигазы. Лизаты клеток HeLa готовили либо с 1% Triton-X (один раз), либо с 1% SDS (три повтора). Из трех лизатов SDS два подвергали удалению SDS перед мечением субтилигазой, а один метили в присутствии SDS. Лизат Triton-X содержал детергент во время мечения. Эффективность мечения определяли вестерн-блоттингом со стрептавидином.Параллельно также проводили вестерн-блоттинг гистона h4 и GFP.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s001

(TIF)

S2 Рис. Субтилигазное мечение eGFP/CVB3-инфицированных клеток HeLa.

(A) Клетки HeLa инфицировали eGFP/CVB3, и за инфекцией следили по обнаружению GFP в указанные моменты времени. DAPI использовали для окрашивания ядер. Изображения в светлом поле (BF) показывают прогрессирующее округление клеток при инфекции. (B) Клетки HeLa, инфицированные eGFP/CVB3 в течение 2, 4 или 6 часов или оставленные неинфицированными, лизировали в 1% SDS.Затем лизаты удаляли из SDS и либо подвергали вестерн-блоттингу для обнаружения GFP и актина (левая панель), либо инкубировали с субтилигазой и биотинилированным пептидом. Эффективность мечения определяли вестерн-блоттингом со стрептавидином. Показаны два разных времени экспозиции.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s002

(TIF)

S3 Рис. Расщепления по мотивам CVB3 2A

pro .

CVB3 2A pro предпочтительно расщепляет белки по парам Y-G, TG, F-G, V-G и AG.Мы рассчитали частоту этих расщеплений в разное время после заражения. Результаты Y-G и TG показаны на рис. 1D, а остальные показаны здесь.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s003

(TIF)

S4 Рис. Валидация белковых расщеплений, идентифицированных мечением субтилигазой.

Клетки HeLa инфицировали eGFP/CVB3 и лизировали при 0, 2, 3, 4, 5 и 6 h.i. с последующим вестерн-блот-анализом указанных белков. Для каждой временной точки загружали равное количество общего белка, определенное количественно с помощью анализа BCA.Экспрессию GFP использовали для мониторинга прогрессирования инфекции (последняя панель). Черные сплошные стрелки указывают на полноразмерный белок, а продукты расщепления показаны красными пунктирными стрелками. Некоторые изображения вестерн-блоттинга показаны на рис. 2.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s004

(TIF)

S5 Рис. Проверка мишеней расщепления путем сверхэкспрессии с последующим вестерн-блоттингом.

(Верхняя панель) Общая схема мечения белков с помощью V5 на N-конце и HA на С-конце.(Нижняя панель) Клетки HeLa, трансдуцированные для стабильной экспрессии указанных белков с двойной меткой, инфицировали eGFP/CVB3 в течение 4 или 6 часов или оставляли неинфицированными с последующим определением расщепления с помощью вестерн-блоттинга. Блоты исследовали с помощью мышиных антител против V5 и кроличьих антител против HA и детектировали с помощью IRDye 680RD козьего антимышиного IgG (красный канал) и IRDye 800CW козьего антикроличьего IgG (зеленый канал). Полноразмерный белок указан сплошными черными стрелками, а продукты расщепления указаны красными пунктирными стрелками.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s005

(TIF)

S6 Рис.

In vitro Анализ расщепления идентифицированных белков.

Лизаты клеток HeLa (200 мкг белка) инкубировали с CVB3 2A pro или его каталитически неактивным мутантом C110A (1 мкг), или CVB3 3C pro или его каталитически неактивным мутантом C147A (100 мкг) при 37°C 3h и анализировали вестерн-блоттингом. Лизаты из неинфицированных и инфицированных eGFP/CVB3 клеток HeLa были включены в качестве положительных контролей.Полноразмерный белок указан сплошными черными стрелками, а продукты расщепления указаны красными пунктирными стрелками. Некоторые изображения вестерн-блоттинга показаны на рис. 3.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s006

(TIF)

S7 Рис. Кинетика роста энтеровирусов в клетках HeLa.

Клетки, инфицированные PV (полиовирус), HRV (риновирус человека A16), EV70 (энтеровирус D-70) и EV71 (энтеровирус A-71), фиксировали в 4% PFA в указанные сроки после заражения и анализировали на экспрессия вирусных капсидных белков с использованием антител, специфичных к каждому вирусу (Материалы и методы).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s007

(TIF)

S8 Рис. Сохранение мишеней расщепления у энтеровирусов.

Список белков-мишеней для расщепления в клетках HeLa, инфицированных eGFP/CVB3, был проверен на предмет их присутствия в наборе протеомных данных указанных вирусов. Плитки, указывающие на обнаружение белков, показанных слева, имеют цветовую кодировку для наглядности.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s008

(TIF)

S9 Рис.Валидация белков-мишеней для нескольких энтеровирусов.

Клетки HeLa, инфицированные CVB3 (eGFP/CVB3), PV (полиовирус типа 1), HRV (человеческий риновирус A16), EV70 (энтеровирус D-70), EV71 (энтеровирус A-71), VEEV (вирус венесуэльского лошадиного энцефалита) или VSV (вирус везикулярного стоматита) лизировали в указанные моменты времени, и равные количества общего белка подвергали вестерн-блоттингу с указанными антителами. Черные сплошные и красные пунктирные стрелки указывают на полноразмерный белок и продукты расщепления соответственно.Некоторые изображения вестерн-блоттинга показаны на рис. 5.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s009

(TIF)

S10 Рис. Тестирование расщепления белков в различных типах клеток.

Клетки HeLa (эпителиальные клетки шейки матки), инфицированные eGFP/CVB3 и PV в течение 6 часов, клетки Caco-2 (эпителиальные клетки кишечника), инфицированные eGFP/CVB3 и PV в течение 8 часов, NPC (нейральные клетки-предшественники), инфицированные eGFP/CVB3 и PV в течение 8 часов 8 ч, клетки RD (рабдомиосаркома) и клетки SK-N-SH (эпителий головного мозга), инфицированные PV в течение 8 ч, анализировали на расщепление указанных белков.Полноразмерный белок показан сплошными черными стрелками, а продукты расщепления — красными пунктирными стрелками.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s010

(TIF)

S11 Рис. LSM14A расщепляется в нейронах стволовых клеток, инфицированных энтеровирусами.

Иммунофлуоресцентные изображения: нейроны эмбриональных стволовых клеток окрашивали на TUJ1, нейрон-специфический белок (левая панель), и на DAPI в качестве ядерного красителя (средняя панель). На правой панели показано объединенное изображение.Вестерн-блоттинг: нейроны инфицировали eGFP/CVB3 или PV в течение 7 часов с последующим вестерн-блоттингом с антителом против LSM14A. Сплошная черная стрелка показывает полноразмерный белок, а красная пунктирная стрелка указывает на С-концевой продукт расщепления.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s011

(TIF)

S12 Рис. MAVS активирует ISRE в отсутствие инфекции SeV.

Клетки 293T, высеянные в 48-луночные планшеты с плотностью 30 000 клеток/лунку, трансфицировали репортерными плазмидами ISRE-FLuc и RL-RLuc вместе с плазмидой GFP (вектор) или увеличивающимися концентрациями плазмиды MAVS (6.25 и 12,5 нг/лунку). Через двадцать четыре часа клетки либо оставляли неинфицированными, либо инфицировали SeV в течение 24 часов с последующим анализом репортеров, как описано на фиг. 7А. В, вектор.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s012

(TIF)

S13 Рис. Характеристики LSM14A-TEVP.

(A) Клетки 293T трансфицировали указанными концентрациями вектора, плазмид LSM14A-WT или LSM14A-TEVP и инфицировали SeV. Репортерный анализ выполняли, как описано на фиг. 7А.(B) Клетки 293T, содержащие dox-индуцируемый TEVP, трансфицировали увеличивающимся количеством плазмиды V5-LSM14A-TEVP-HA, и экспрессию TEVP индуцировали с использованием указанных концентраций доксициклина. Расщепление LSM14A контролировали вестерн-блоттингом с антителами против HA. Небольшое количество продукта расщепления, наблюдаемое в необработанных клетках, отражает негерметичность промотора dox.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s013

(TIF)

Файл S1.Белки, расщепленные в клетках HeLa, инфицированных CVB3, через 4 часа после заражения.

Показан список расщепляемых пептидов и соответствующих им белков. Белки, расщепленные по мотивам 2A pro , выделены синим цветом, а белки, расщепленные по мотивам 3C pro , выделены красным. Более подробную информацию можно найти на листе «Read me» в файле Excel.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008927.s014

(XLS)

Клиническая картина энтеровирусной инфекции у детей

Клиническая картина энтеровирусной инфекции у детей — Health Research Authority HRA Health Research AuthorityЗащита и продвижение интересов пациентов и общественности в исследованиях в области здравоохранения.

Веб-сайт Управления медицинских исследований использует основные файлы cookie

Этот сайт использует файлы cookie сеанса и постоянные файлы cookie для улучшения содержания и структуры сайта.

Принять все файлы cookie См. политику использования файлов cookie

Этот сайт использует файлы cookie. Продолжая просматривать сайт, вы соглашаетесь на использование нами файлов cookie.

  • Тип исследования

    Исследование

  • Полное название

    Клиническая картина энтеровирусной инфекции у детей и болезнетворных серотипов энтеровирусов в Великобритании.

  • IRAS ID
    IRAS ID

    157403

  • 0
  • Marc Tebruegge

  • контактный адрес электронной почты

    [email protected]

  • Спонсорская организация

    университетская больница университета Southampton NHS Trust

  • Резюме исследований

    Энтеровирусы человека исторически подразделялись на эховирусы, вирусы Коксаки А и В и полиовирусы. Эта традиционная таксономия основана на свойствах репликации в культуре, а также на спектре клинических симптомов, вызываемых заражением этими вирусами человека.С 1960-х годов, вместо того чтобы относить к одной из четырех основных групп, вновь идентифицированным энтеровирусам давали числовое обозначение («нумерованные энтеровирусы», например, энтеровирусы с 68 по 71).
    Неполиомиелитные энтеровирусы могут вызывать широкий спектр острых заболеваний с клиническими проявлениями от неспецифической лихорадки, легкой инфекции верхних дыхательных путей или самокупирующегося гастроэнтерита до более тяжелых форм, таких как миокардит, гепатит и энцефалит. Имеются некоторые данные, позволяющие предположить, что определенные проявления, как правило, связаны с определенной группой энтеровирусов или даже с определенным серотипом, например, герпетическая ангина (вирусы Коксаки А), ящур (вирусы Коксаки А (часто А16), энтеровирусная 71), перикардит/миокардит (вирусы Коксаки В), плевродинию (болезнь Борнхольма; вирусы Коксаки В) и геморрагический конъюнктивит (вирус Коксаки А24, энтеровирус 70). ограниченное.Кроме того, имеются данные как из Европы, так и из Северной Америки, показывающие, что преобладающие серотипы энтеровирусов постоянно изменяются с течением времени. Нет опубликованных эпидемиологических данных о болезнетворных серотипах энтеровирусов в Великобритании за последние два десятилетия.
    Клиническая картина энтеровирусной инфекции у детей зависит от серотипа энтеровируса. Проводя ретроспективное исследование существующих микробиологических и клинических данных, мы стремимся охватить спектр клинических проявлений энтеровирусных инфекций у детей, получавших помощь в Университетской больнице Саутгемптона (UHS) NHS Foundation Trust, и описать любые связи между серотипом энтеровируса и клиническими проявлениями. .Кроме того, мы хотели бы сравнить местные данные о серотипах с национальными данными о серотипах, предоставленными Public Health England.

  • REC REC

    Wales Rec 6

  • Rec ReCa / 1024
  • 14 / WA / 1024

  • Дата повторения

    4 июн 2014

  • REC мнение

    Выгодное мнение

Будьте в курсе последних новостей, обновлений правил и предстоящих обучающих мероприятий

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.